2019 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
18K05545
|
|---|
| Research Institution | University of Tsukuba |
|---|
Principal Investigator |
竹下 典男 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (20745038)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 糸状菌 / 菌糸 / カルシウム / アクチン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
①躍動性に関わる分子機構
Calmodulin-dependent kinase, CmkA, CmkB, CmkCにGFPを付加した融合タンパク質を発現する株を構築し、それぞれの細胞抽出液に対してGFP抗体によるGFP-Trapを行い相互作用するタンパク質群を精製した。それらをLC-MS/MSの質量分析にかける事で、CmkB-GFPと相互作用するタンパク質群を明らかにした。CmkC-GFPを発現する株でも同様の実験を行ったが、タンパク質量が少ないことが原因で相互作用するタンパク質群を同定することは出来なかった。CmkA, CmkBで、26Sプロテアソーム、タンパク質分解系のタンパク質群が同定されたが、下流のターゲットは異なることが判明した。ステロール修飾や他のシグナル伝達経路のタンパク質群も同定されたが、こちらも下流のターゲットは異なっていた。今後、CmkC-GFPを発現する株で、GFP-TrapとLC-MS/MSの質量分析で、相互作用するタンパク質群を明らかにする。CmkA, CmkB, CmkCの間での、相互作用するタンパク質の共通性と差異を明らかにする。
②外的シグナルに応答した躍動性の変化
共焦点顕微鏡ベースでポイントレーザーを使う事で細胞の目的部位にストレスを与えた際の、躍動性の変化、即ち、アクチンの重合、エキソサイトーシス、Ca2+の流入、菌糸生長を、蛍光イメージングにより観察し、解析した。今後、データ解析を継続し、論文を完成させる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①躍動性に関わる分子機構
Calmodulin-dependent kinase, CmkA, CmkB, CmkCにGFPを付加した融合タンパク質を発現する株を構築し、それぞれの細胞抽出液に対してGFP抗体によるGFP-Trapを行い相互作用するタンパク質群を精製した。それらをLC-MS/MSの質量分析にかける事で、CmkB-GFPと相互作用するタンパク質群を明らかにした。CmkC-GFPを発現する株でも同様の実験を行ったが、タンパク質量が少ないことが原因で相互作用するタンパク質群を同定することは出来なかった。CmkA, CmkBで下流のターゲットが異なることが判明した。
②外的シグナルに応答した躍動性の変化
共焦点顕微鏡ベースでポイントレーザーを使う事で細胞の目的部位にストレスを与えた際の、躍動性の変化、即ち、アクチンの重合、エキソサイトーシス、Ca2+の流入、菌糸生長を、蛍光イメージングにより観察し、解析した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
①躍動性に関わる分子機構
CmkC-GFPを発現する株で、GFP-TrapとLC-MS/MSの質量分析で、相互作用するタンパク質群を明らかにする。CmkA, CmkB, CmkCの間での、相互作用するタンパク質の共通性と差異を明らかにする。
②外的シグナルに応答した躍動性の変化
データ解析を継続し、論文を完成させる。
|
| Causes of Carryover |
予想外の結果が出るなど研究の進捗状況により、必要な実験費用の使用が次年度になった。
|
