2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K05549
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
石井 智浩 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (60549947)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中田 隆夫 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (50218004)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 光遺伝学 / オプトジェネティクス / 細胞内シグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
BphP1とQPAS1は近赤外光に応答して可逆的に結合・解離をおこなう。QPAS1を最初から細胞膜に局在させることで、BphP1を光依存的に細胞膜へと局在させることができる。BphP1とQPAS1のこのような性質を利用して、細胞増殖に関わるRas-ERK系のシグナルとDNA組換え酵素Creの活性を操作する光遺伝学ツールの作製を試みた。
Ras-ERK系のシグナル操作の方法としてRasの制御因子SOS2を利用した。SOS2の活性化ドメインを光依存的に細胞膜へと移動させることで、Ras-ERK系のシグナルが活性化される。QPAS1を細胞膜に局在させるためにC末端にCAAXシグナル配列を付加する。BphP1-SOS2とQPAS1-CAAXが常に一定の比で発現するように2Aペプチドを間に挿入したコンストラクトを作製した。培養細胞に発現させて近赤外光を照射したところ、BphP1-SOS2が細胞膜へ移行する様子が観察された。
DNA組換え酵素Creの活性を光操作する方法として、Creを２つのタンパク質に分割したsplit Cre（N-CreとC-Cre）を用いた。N-CreとC-CreをそれぞれBphP1とQPAS1と融合させ、光依存的にCreが活性型になるという仕組みである。スクリーニング系としてCre依存的に赤色蛍光タンパク質の発現が緑色蛍光タンパク質の発現へと変化するHEK293細胞を使用した。上記のCreコンストラクトを細胞に導入して、近赤外光を24-48時間照射した。対照の近赤外光照射なしの細胞に比べ照射した細胞ではDNA組換え効率の上昇が見られた。しかしながら光照射なしでもDNA組換え率が高く、大きく改善する必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、BphP1とQPAS1を利用した光遺伝学ツールの開発を進めることができた。シグナル分子を光依存的に細胞膜へ移行させることができたこと、遺伝子組換え酵素に関して光照射の有無で活性に違いが出せたことは、改善の余地があるとはいえ十分な進展があったと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
SOS2の光スイッチに関しては、その活性化によって誘導されると予想されるPIP3やカルシウムシグナルの解析を行う。ラット褐色腫由来細胞PC-12細胞を用いて、細胞分化の実験を行う。PC-12細胞はSOS2の活性制御により神経突起伸長を誘導することができる。青色光によって制御できるPIP3、cAMP、カルシウムシグナルと組み合わせて、より複雑な細胞内シグナルの解析を行う。
Creに関しては暗条件下でのDNA組換え活性を抑制する工夫が必要である。BphP1、QPAS1、N-Cre、C-Creの融合の仕方（位置関係やリンカーの長さなど）を様々に変化させて検討していく。BphP1とQPAS1の暗条件下での相互作用は細胞の培養条件が影響している可能性があり、その点も並行して検討する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大に伴い学会が誌上開催と変更されたため、旅費として計上していた学会参加関連経費に変更があった。
次年度はこれまでの基礎的な研究から応用研究へと発展させ、新規試薬を購入することになる。また最終年度となるので、積極的に学会発表する予定である。
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