DNA/RNAヘテロ2本鎖核酸を切断するヌクレアーゼの同定および作用機序解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05550
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 浅田 健 国立研究開発法人理化学研究所, 革新知能統合研究センター, 研究員 (70773414)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 核酸医薬 / ヘテロ2本鎖核酸 / 一本鎖核酸

Outline of Annual Research Achievements

2018年度の本研究開始以降、本研究代表者が構築した新規手法を用いて、マウスの肝組織からヘテロ2本鎖核酸（HDO: Heteroduplex oligonucleotide）に結合すると考えられる、候補タンパク質を複数同定した。複数の候補タンパク質のうち、さらなる実験結果から2つのタンパク質に絞り、より詳細な解析に進むことにした。同時並行して、既報およびバイオインフォマティクス解析より、追加で2つの候補タンパク質を得、計4つのタンパク質に対して作用機序を含む、詳細な分子機構解明の研究にとりかかった。
具体的にはHDOに結合するタンパク質が、HDOによる遺伝子発現制御能に与える効果を検討するために、マウス由来培養細胞を用いてノックダウン細胞を樹立した。これらノックダウン細胞を用いた実験結果から、4つのタンパク質いずれもがHDOの効果を促進することが明らかとなった。そこでこれらタンパク質がHDOのトラフィッキングも含めて、細胞内でどのように関わっているのかを検討するために、蛍光顕微鏡および免疫沈降法を用いて、タンパク質タンパク質相互作用を解析を行った。その結果、複数のタンパク質間で、複合体を形成していることが明らかとなった。
そこで、これらタンパク質のHDOに対する化学的特異性を検討するために、異なる配列のHDO、異なるリン酸バックボーンのHDO、および1本鎖ASO(antisense oligonucleotide)に対する結合能比較検討を行い、HDOに対する、結合タンパク質の網羅的なcharacterization検討し、新規知見を得た。
本研究の成果により、これまでに不明であったHDO依存的な遺伝子発現制御機構が明らかとなり、本研究成果は、Nucleic Acids Researchへ投稿し、現在、2nd round revisionである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究実績の概要でも記載した通り、ヘテロ2本鎖核酸に結合するタンパク質を複数同定し、詳細な機能解析も検討した。これら新規知見により、これまでに解明されていなかった詳細なメカニズムが明らかとなり、今後はHDOの配列デザインや、副作用の低減、標的組織の選別なと、次のステップへの大きな経験と知識が得られたと感じている。研究成果は論文として投稿済であり、現在リバイス中であることから、おおむね順調に進展していると自己評価した。

Strategy for Future Research Activity

2020年度は本研究課題の最終年度であり、研究成果を世の中に導出することに注力する。具体的には現在リバイス中の論文が今年度中にアクセプトされるように、鋭意努力していく予定である。

Causes of Carryover

当初の予定よりも研究が進展したため、不要な抗体や実験をする必要がなくなり、研究費の節約に繋がった。一方で今年度は、論文のリバイス対応のために、当初の研究計画になかった実験を行う必要があり、また、論文受理後は、論文掲載費、学会参加費などに使用する予定である。