2019 Fiscal Year Research-status Report
トランスクリプトームビッグデータ解析を活用した高油脂生産Coccomyxaの創生
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18K05561
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
笠井 由紀 中央大学, 研究開発機構, 専任研究員 (20416572)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ゲノム編集技術 / 遺伝子破壊 / DYRK遺伝子 / TOR遺伝子 / RNA-seq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに解析したRNA-seqデータは、突然変異誘発剤によって得た低クロロフィル変異株を使用したもので、DYRK遺伝子以外の多くの遺伝子に突然変異が起きているため、純粋にDYRK遺伝子の影響を調べるのには問題があった。また、RNAを抽出した細胞のサンプリング時期と脂質の合成時期がずれていた。そこで、前年度ゲノム編集で作成したDYRK遺伝子破壊株と野生株を使用し、脂質合成が活発になる時期の細胞からRNAを抽出、RNA-seq解析を行った。以前のデータと比較して、DYRK遺伝子の影響による脂質合成の増加に関連している遺伝子の特定を行っている。
DYRK遺伝子破壊株について、生育曲線、細胞のサイズ、クロロフィル量等脂質合成以外の性質について調べた。その結果、DYRK遺伝子破壊株は野生株と比較して脂質合成が起こる窒素欠乏条件での分裂が抑制されるが、細胞のサイズが大きくなるため、バイオマスが上昇することが明らかとなった。また、窒素欠乏条件でクロロフィルの含有量が野生株と比較して高いため、培養後期でも活発な活性を持つことが示唆された。
また、脂質合成系においてDYRK遺伝子の上流に位置していると報告のあるTOR遺伝子をゲノム編集技術により破壊した株を作成した。DYRK遺伝子破壊株と生育や細胞のサイズについて比較した。
窒素欠乏条件で転写活性が上昇するアンモニウムトランスポーター（AMT1）遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子GUSと連結して、転写活性を解析した。その結果、外来遺伝子を連結した場合AMT1プロモーターの転写活性は元の活性よりかなり劣ることが判明した。転写産物を詳細に解析したところ、３’末端からの分解が進んでいることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DYRK遺伝子破壊株を利用した脂質合成活性が上昇する時点の遺伝子の発現状況の解析を進めたことで、脂質合成を促進する可能性の高い遺伝子の特定が進んでいる。さらに、上流に位置するTOR遺伝子の影響と比較することで、遺伝子の転写活性に関与している遺伝子の推定ができつつあるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
19年度に解析したRNA-seqデータをさらに精査し、脂質合成関連遺伝子の発現調節に関与している遺伝子を特定する。候補遺伝子についてはリアルタイムPCRで発現の確認を行う。また、野生株での過剰発現を行って脂質合成を解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、ゲノム編集による突然変異株の作製が予定よりもうまくいったために、試薬等の使用量が少なく済んだことと、RNA-seq用のサンプル調整とそれに続く外注に時間がかかったため、それ以降に行う予定であったリアルタイムPCRの実施に着手できなかったためである。今年度は、RNA-seqで得られたデータを基に遺伝子発現の解析、および過剰発現株の作製、ゲノム編集技術での遺伝子破壊株の作製を計画しており、それらの実験に使用する試薬、消耗品の購入、および論文発表の準備に使用する予定である。
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