2018 Fiscal Year Research-status Report
Updating of the artificial 'sports' breeding techniques using grafting
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18K05567
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
葛西 厚史 弘前大学, 農学生命科学部, 研究機関研究員 (80633982)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | エピゲノム編集 / 接ぎ木 / RdDM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① エピゲノム編集の効率化 まずは外来遺伝子（35S:GFP）を標的としたモデル実験系を利用し、今回新たに作出したROS1遺伝子抑制コンストラクト２重siRNA供与ジャガイモ及び高24 nt siRNA産生ジャガイモを穂木として接ぎ木した時のGFP蛍光観察ならびにメチル化度解析等様々な手法を用いて効率化について比較調査した。ノーザンブロット分析によりROS1 siRNA、あるいは35S siRNAの産生性を評価し、より有望な系統との接ぎ木を実施した。さらに、内生遺伝子を標的とするsiRNA供与ジャガイモに対しても、これらのコンストラクトの形質転換を行い、効率化siRNA供与ジャガイモの作出を進めた。
② 汎用的活用化 複数の栽培品種の培養体の獲得並びに標的とする遺伝子配列の確認を行った。その結果、複数の１塩基多型など確認されたが、大きな欠失・挿入などは確認されなかったため、これまでのsiRNA供与ジャガイモを用いて接ぎ木を行いエピゲノム編集系統の作出を進めた。各10個体以上の接ぎ木を実施し、接ぎ木個体の栽培品種の側根から再分化を行った。標的とする内生遺伝子の当該形質（でん粉組成の改変）は、ジャガイモの塊茎形質に関しているため、培養によって作製することができる小塊茎（マイクロチューバー）を用いて解析を行うことで研究の加速化を図った。
③ 適用植物種の拡張－リンゴへの応用－ エピゲノム編集系統獲得に関する技術は取得済みであるため、siRNA供与体（遺伝子組換え体）の獲得が課題となる。そこで、高形質転換効率であると報告があった台木品種を分譲していただき、この台木品種での形質転換を進めた。また、形質転換をせずに一過的な発現によって産生されたsiRNAによるエピゲノム編集誘導についても検討した。本研究内容については、日本育種学会第135回講演会にて報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請課題において取り組んでいる３課題のうち、① エピゲノム編集の効率化及び② 汎用的活用化については、それぞれのシステムを組み込んだsiRNA供与体（遺伝子組換えジャガイモ）を複数系統作出することができたため、接ぎ木を実行する過程に順調に進めている。さらに、本申請課題において新たに実施した③ 適用植物種の拡張－リンゴへの応用－については、おおむね順調に進めれているため、これまで得られた成果を学会にて発表した。また、３課題について研究協力者である原田竹雄弘前大学名誉教授とも適宜議論を重ね適切に研究遂行した。
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| Strategy for Future Research Activity |
① エピゲノム編集の効率化 まずは外来遺伝子（35S:GFP）を標的としたモデル実験系を利用し、GFP蛍光による可視的なエピゲノム編集誘導の効率化を検討する。すなわち、Kasai et al. (2016)が報告した実験系と今回新たに作出したROS1遺伝子抑制コンストラクト２重siRNA供与ジャガイモ及び高24 nt siRNA産生ジャガイモを穂木として接ぎ木した時のGFP蛍光観察ならびにメチル化度解析等様々な手法を用いて効率化について比較調査する。さらに、ROS1抑制系統あるいは高24 nt siRNA産生系統に対し、内生遺伝子を標的とするコンストラクトも導入し、内生遺伝子のエピゲノム編集系統作出効率化についても検討していく。
② 汎用的活用化 複数の栽培品種の培養体を獲得することができている。また、それらの品種について標的とする遺伝子配列の確認も行っている。したがって、接ぎ木を行いエピゲノム編集系統の作出を進め、DNAメチル化解析により高メチル化系統を獲得する。Kasai et al. (2016)に報告した内生遺伝子の当該形質（でん粉組成の改変）は、ジャガイモの塊茎形質に関している。したがって、形質を調査するには塊茎の作出が必要となるため、培養によって作製することができる小塊茎（マイクロチューバー）を用いて解析することにより加速化することができると考えている。
③ 適用植物種の拡張－リンゴへの応用－ エピゲノム編集系統獲得に関する技術は取得済みであるため、siRNA供与体（遺伝子組換え体）の獲得が課題となる。そこで、高形質転換効率であると報告があった台木品種を分譲していただき、この台木品種での形質転換を進めている。また、形質転換をせずに一過的な発現によって産生されたsiRNAによるエピゲノム編集誘導についても検討してみる。
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| Causes of Carryover |
学会発表のために計上した旅費が、関東（千葉大学）開催であったため想定より１日短くすることができた。また、実験補助に支払う予定であった謝金が、想定していたよりも時間数を確保することができなかったため、次年度使用額が生じてしまった。翌年度分として、謝金あるいは物品費（高効率あるいは高速性を有する酵素などを購入）として利用し研究が加速的に進行するように使用したい。
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