サツマイモの効率的な交配育種のための基盤整備

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05573
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 土屋 亨 三重大学, 地域イノベーション推進機構, 准教授 (30293806)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 交配不和合性 / 自家不和合性 / サツマイモ / 自他認識

Outline of Annual Research Achievements

サツマイモ栽培種（Ipomoea batatas）は交配不和合性を有しており、同一の交配不和合群に属する個体間では交配を行えないため、我が国が有している多種多様なサツマイモ栽培種を用いた効率的な交配育種が妨げられている。この交配不和合性は自家不和合性と同一のシステムにより制御されるが、我々は、サツマイモ栽培種の近縁野生種であるメキシコアサガオ（I.trifida）の自家不和合性遺伝子座の解析を通して、自家不和合性の自他認識に直接的に関与しているタンパク質遺伝子（S遺伝子）の最有力候補、ItAB2とItSEAを同定した。これらを元に、サツマイモ栽培種からIb-AB2とIbSEAを同定し、その交配不和合性を人為的に制御するのが本研究の目的である。
研究開始初年度である昨年度は、ItAB2とItSEAをメキシコアサガオに導入し、これらが真のS遺伝子であるか否かの検討を行ったが、着花効率が悪く、また着花したとしても花粉稔性が極めて低かった。これは遺伝子導入から再分化に至るまでに長期間に渡ったことが影響したと思われた。
また、サツマイモ栽培種の雄側S遺伝子IbAB2を葯から、雌側S遺伝子IbSEAを柱頭から単離するために、交配不和合群A～Kに属する品種・系統を栽培し、短日処理により開花促進を行い生殖器官の単離を行い、一部についてmRNAの精製を行った。これらmRNAを鋳型として、S1-, S3-, S10-, S29-,Sc-系統のItAB2およびItSEAを増幅できるプライマーを複数種用意してRT-PCRを行ったが、IbAB2, IbSEAの増幅は確認できなかった。S遺伝子型間の多様性が激しいために、単純な増幅が困難だったことが推定された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

メキシコアサガオ（Ipomoea trifida）のS候補遺伝子であるItAB2とItSEAが真のS遺伝子であることを証明するためには、これら遺伝子を導入しgain-of-functionの実験を行う必要がある。研究開始初年度は、S10ホモ型系統にS1-S候補遺伝子を導入した。この場合、S1がS10よりも優性であるために単に表現型を確認することで可能であると思われたが、遺伝子導入したS10ホモ型系統の稔性が低下しており、また、長期にわたる培養により着花が低下した。この点に関しては、昨年度中に、S3Sc個体の自殖種子（Sc（自家和合性変異）はS3よりも優性であるため自殖が可能）を300個程度獲得しており、これらからScホモ型個体を選別して遺伝子導入実験に供する。
また、サツマイモ栽培種の雄側S遺伝子IbAB2を葯から、雌側S遺伝子IbSEAを柱頭から単離するために、交配不和合群A～Kに属する品種・系統を栽培し、短日処理により開花促進を行い生殖器官の単離を行った。得られた生殖器官の一部からmRNAの精製い、これらmRNAを鋳型として、S1-, S3-, S10-, S29-,Sc-系統のItAB2およびItSEAを増幅できるプライマーを複数種用意してRT-PCRを行ったが、IbAB2, IbSEAの増幅は確認できなかった。一方、既に明らかになっているサツマイモ栽培種ゲノムに対し、ItAB2, ItSEAの相同遺伝子の存在を調査したところ、AB2やSEAと相同な遺伝子が存在していることが確認された。このことから、サツマイモ栽培種にIbAB2やIbSEAが存在してはいるもののS遺伝子の多様性によってRT-PCRによる増幅ができなかった可能性が示唆された。
当初予定では、初年度中にcDNAライブラリーの構築とスクリーニングを行う予定であったが、2年目に実施することとなった。

Strategy for Future Research Activity

メキシコアサガオ（Ipomoea trifida）のS候補遺伝子であるItAB2とItSEAが真のS遺伝子であることを証明するため、現在栽培中のS3Sc自殖後代からScホモ型系統を選抜し、無菌化した後にItAB2とItSEAの導入を行い、得られる形質転換体を用いて相互交配および自殖を行う。形質転換体中に存在する自家不和合性に直接関与するS遺伝子は導入する遺伝子以外には存在せず、導入した遺伝子の直接的効果が確認できることが期待される。なお、Sc系統のS遺伝子座の配列解析は既に終了しており、当該遺伝子座上に機能する形のItAB2とItSEAが存在しないことが明らかになっていると共に、Sc系統については自家和合性変異体でありながらS遺伝子間の優劣性を維持していること、Scが如何なるS遺伝子型とのヘテロを形成したとしても自家不和合性/和合性の表現型を示すことから、Sc系統自体は自他認識因子のみの変異であることが推定されている。
サツマイモ栽培種（I.batatas）の交配不和合性に直接的に関わるIbAB2, IbSEAを単離すべく、これまでに得られている各種サツマイモ栽培種の生殖器官よりmRNAを単離しcDNAライブラリーを調製してスクリーニングを行う。メキシコアサガオのSヘテロ系統においては劣性側のAB2は転写が抑制されていることから、まずは各サツマイモ栽培種の葯から、各交配不和合群において最優性のAB2の単離を試みる。また同時に次世代シークエンサーを用いてRNAseqを試み、ItAB2およびItSEAの相同遺伝子のスクリーニングも試みる。
更に、It-S遺伝子の単離と構造解析を進めるべく各種サツマイモ栽培種のゲノムライブラリーの構築に着手することを予定しているが、研究進捗状況の遅れを取り戻すべく、長鎖の解読ができる次世代シークエンサーの利用も考える。

Causes of Carryover

当初計画していた、It-S候補遺伝子を導入したメキシコアサガオ（Ipomoea trifida）の形質転換体を用いた交配実験が、着花不良ならびに低稔性のために達成できなかったため、当初年度の実験を次年度にまわさざるを得ず、次年度使用額が発生した。また、各交配不和合群に属するサツマイモ栽培種（Ipomoea batatas）をキダチアサガオ（Ipomoea nil）に接ぎ木して開花誘導を行う予定であったが栽培に失敗し、短日処理のみによる開花誘導をせざるを得ず、cDNAライブラリーの作成とスクリーニングが遅れ、次年度使用額が発生した。
2年目である本年度においては、これらの遅れを取り戻すべく実験を進めるため、当初計画の申請額と次年度使用額を合わせ、効率的に実験を進め、進捗状況の遅れを取り戻す。

Research Products

• [Journal Article] Phylogenetic Study of Metroxylon Palms in Southeast Asia and Oceania Based on 5S nrDNA Spacer Sequence Data (2019)
  • Author(s): Hiroshi Ehara, Toshiki Yamamoto, Tohru Tsuchiya, Hitoshi Naito, John L. Dowe, Will C. McClatchey , Takashi Mishima , Akemi Itaya , Chitoshi Mizota , YuliusB.Pasolon,PhilimonAla ,MarikaTuiwawa ,Alivereti Naikatini , Issac A. Rounds , Talie Foliga , Siosinamele Lui and Samantha Kwan
  • Journal Title: SAGO PALM Volume: 26 Pages: 34-43
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research