2018 Fiscal Year Research-status Report

Abortion of germ cells and reproductive barriers due to maladaptive haplotype block in rice

Research Project

Project/Area Number	18K05576
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	山形悦透九州大学, 農学研究院, 特任助教 (00600446)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	雑種不稔 / 接合後生殖的隔離 / 減数分裂 / イネ
Outline of Annual Research Achievements	栽培イネOryza sativaとO. glaberrimaの種間雑種後代において見出されたS18遺伝子はヘテロ接合体における生殖細胞の形態異常、強度の花粉不稔および分離歪みを引き起こす。本研究ではS18の分子遺伝学的な基盤を解明し、S18非適応ハプロタイプの分子的実体およびその進化経路を明らかにし、雑種不稔を打破する高親和性系統確立への理論的基礎を構築する。 <研究項目1> S18BとS18Tの相補性検定を行った。S18領域はS18B座およびS18T座の二つの領域に分割され、両領域がヘテロ接合型の時に高不稔となる。両領域がヘテロ接合型で高不稔をしめす個体に、日本晴由来LOC3ゲノム断片を形質転換したT0/T1個体にて花粉稔性の顕著な上昇がみられたことからLOC3はS18B座の原因遺伝子であることが分かった。次にS18Tの単離を行った。S18B領域がヘテロ接合型、S18T領域がO. glaberrimaホモ接合型の個体は花粉正常を示すが、この個体に日本晴由来LOC6ゲノム断片を導入した形質転換体T0個体は花粉稔性がほぼゼロであった。このことからLOC6がS18T座の原因遺伝子と結論した。 <研究項目2> 高不稔を示すS18ヘテロ接合体についてLOC3あるいはLOC6の欠損変異体を作成し、評価する。LOC3遺伝子を対象としたgRNAおよびCAS9を含むバイナリーベクターを作成し、ヘテロ接合体に形質転換を行ったが、変異導入にいまだ至っておらず欠損個体の獲得に至らなかった。 <研究項目3> 減数分裂細S18BとS18Tの機能解析を行う。LOC3の抗体を作成し、正常個体と高不稔個体における花粉母細胞、減数分裂細胞での免疫染色を行った。その結果、LOC3は核および減数分裂中の染色体に局在していた。さらに減数第一分裂後期には分裂面周辺に局在したことから隔膜形成体と関連していると推察された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason <研究項目1> S18BとS18Tの相補性検定については、予定通り進捗している。S18Tの相補性検定についてはT0個体の検定にて表現型が再現されたが、不稔のため後代種子を得ることができなかった。株保存個体を再度育成し、表現型の再確認を行う。候補ゲノム領域内の他の遺伝子については、ネガティブデータ収集のため、形質転換実験を継続して行う。また、分離ゆがみの原因変異を1つに絞り込んだが、形質転換実験による証明は行われていない。順遺伝学的には特定できている状況ではあるが、1SNP置換コンストラクトによる証明に着手する必要がある。 <研究項目2> 欠損変異体の作成については、CRISPR/Cas9による変異導入が遅れている。これまで用いてきたベクターとは異なるベクターを用いて、複数個所のgRNAを設計し、欠損変異体の作出に着手している。当初計画では遺伝的背景にもちいた日本型栽培イネ台中65号(T65)に変異導入を行い、S18-glaberrima 近似同質遺伝子系統(NIL)との交雑F1の表現型解析を行う予定であったが、両系統の交雑F1に形質転換および変異導入を行い、進捗の加速を計画している。 <研究項目3> 当初計画では染色体の二重鎖切断(DSB)のリン酸化抗体による観察を予定していたが、LOC3タンパク質の抗体が完成し、LOC3が機能する場を確定させることが可能になったため、本年度はLOC3タンパク質の免疫蛍光染色を優先して行った。LOC3は染色体に直接あるいは間接的に局在しており、DNA修復に関与している可能性が高まったと考えられるので、染色体の二重鎖切断(DSB)のリン酸化抗体による観察をすすめる。また、LOC3は微小管が構成要素である隔膜形成体と関連するデータが得られており、微小管の免疫染色を行ったが、複数の抗体を試したものの微小管の観察には至っていない
Strategy for Future Research Activity	<研究項目1> S18B領域より1因子(LOC3)、S18T領域より一因子(LOC6)を高不稔の必要因子として特定したが、この二因子で高不稔が十分に引き起こされるかは不明である。そのため両遺伝子を同時に導入することで高不稔が引き起こされるかを検討する。 <研究項目2> CRISPR/Cas9による欠損変異体の作成を進めているが、変異導入効率が低いため複数のgRNAを設計し、再度形質転換体の作成と変異導入を行う。並行して九州大学が保有するイネTILLING変異系統群より変異体のスクリーニングを継続的に行う。またO. glaberrimaのコアコレクション品種群のハプロタイプ解析をすすめているので、当該領域に関する多様な対立遺伝子の収集を進める。 <研究項目3> 高不稔にはLOC3とLOC6の両因子がヘテロ接合型になることが必要であり、遺伝的な相互作用が認められる。両遺伝子が発現し、相互作用する場があると考えられる。そこで、LOC3とLOC6、および生殖細胞発達時期に発現が知られている主要な遺伝子についてQRT-PCRによる転写産物の測定を行うとともに、LOC3とLOC6に関してはin situ hybridzationによる発現解析を行う。物理的な相互作用についても検討を行うため、Yeast-two-hybrid解析によるLOC3とLOC6間の相互作用について検討を行う。また、樹脂包埋切片の作成を現在進めているので、各成長ステージにおける形態異常、特にタペート崩壊時期について詳細な観察を進めるとともに、TUNELアッセイによるProgrammed cell deathによる積極的な細胞死がS18高不稔個体にて起こるかを検討する。
Causes of Carryover	本年度遺伝子単離によって明らかとなった関連タンパク質の抗体(16~19万円程度)購入を年度内に執行する予定であったが、年度内に作成が間に合わなかったため、次年度使用分として計画している。