2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a massively parallel SNP-typing method for rapid and efficient identification of responsible genes in mutants
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18K05587
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
市田 裕之 国立研究開発法人理化学研究所, 仁科加速器科学研究センター, チームリーダー (80513382)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | イネ / SNPタイピング / 耐塩性 / 変異体 / 重イオンビーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
変異解析パイプラインを用いてイネ品種間に存在する一塩基多型（SNP）を抽出し、微細半導体技術を用いて少量の合成オリゴDNA混合物を合成した。このDNA混合物を限られたサイクル数のPCRで増幅することで、配列多様性を維持したまま大量のDNAテンプレートが得られることを示した。このDNAをテンプレートに試験管内でビオチン化RNAプローブを合成し、イネ6品種を用いて実際にターゲット濃縮を行ったところ、タイピング対象として選定したSNPを含む領域を濃縮し、遺伝子型を決定することができた。また、プローブを設計するターゲット領域長をSNP座乗部位の前後50-200 bpに変化させて同様の実験を行ったところ、SNP前後各50 bpをターゲットとした場合でも実用的な感度でSNPの遺伝子型を決定可能であることを示した。より大規模な集団を対象としたSNP濃縮を評価するため、ミヤコグサの組換え自殖系統（RIL）120系統を用い、ランダムに抽出した22,327のSNP座位をターゲットにSNP濃縮を行った。その結果、8サンプルを予め混合してシーケンシングした場合でも大部分のSNP座の遺伝子型を正確に決定可能であり、本法の有用性を実証した。
本法を応用してイネ耐塩性変異体の原因遺伝子を同定するため、耐塩性変異体に親品種である日本晴を戻し交雑した自殖後代を塩害水田で栽培した。F2世代で耐塩性が強かった個体の後代を列植えで評価すると、通常の劣性遺伝とは明らかに異なる分離比で非常に強力な耐塩性を有する個体が出現した。穀粒判別機を用いて塩害水田で収穫した34系統・171個体の種子を測定したところ、塩害水田での耐塩性評価が、種子の大きさ（投影断面積）および厚みと高い相関を有することが分かった（p<0.01）。今後、これらの形質を指標に、非メンデル遺伝が原因の可能性も想定しながら遺伝子単離を進める予定である。
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