2019 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis and application of nitrogen fertilizer-responsive rice amylases
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18K05605
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
黒田 昌治 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 中央農業研究センター, 上級研究員 (30355581)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
朝倉 富子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任教授 (20259013)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | コメ / 品質 / 窒素肥料 / アミラーゼ / デンプン / 遺伝子発現 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出穂期の窒素追肥は、コメの増収をもたらす一方で食味や加工特性を低下させることから、農業生産向上には両者の負の相関を解消する必要がある。我々はベータアミラーゼ3および5(BAMY3、BAMY5)、アルファアミラーゼ3E(Amy3E)の3遺伝子が、窒素追肥に応答して発現上昇することを初めて明らかにした。本研究では、これらの窒素応答型アミラーゼ遺伝子群と品質の関係性を明らかにする。さらに、窒素応答型アミラーゼ遺伝子の欠損変異等を利用して、新たな品質特性を持った育種素材の開発をめざす。
R1年は、H30年と同様に窒素追肥試験を進めつつ、デンプン構造の変化を別の分析法で追試した。窒素追肥によりデンプン鎖長が変化することは再確認できたものの、圃場試験では試験区間に有意な差が認められず、また解析法により結果が異なった。電子顕微鏡観察では、試験区間でデンプン粒の形状に明確な差は見られなかった。H30年に作成したベータアミラーゼ抗体は、種子抽出タンパク質に特異的反応が見られなかった。H30に選抜した窒素応答型アミラーゼ3重破壊系統は、稔実率が非常に低くて種子増殖が困難であると判明し、2重破壊体とともに3重破壊体の再選抜を行った。ベータアミラーゼプロモーター領域、コード領域は長い遺伝子断片（約2kbp）のPCR増幅が難しく、計画していた組換え植物の作製に至らなかった。
総合的に考察すると、窒素追肥によって胚乳デンプンの鎖長が変化すること、その変化はデンプン粒の形態までに影響するほどではないこと、という新知見は確認できたと判断する。一方で、アミラーゼ群とデンプン鎖長変化の関係性については、具体像を明らかにできなかった。最終年度となるR2年度は、窒素追肥・デンプン鎖長変化・ベータアミラーゼ群の相互の関係性について、一定の結論を得ることを目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
圃場および人工気象機を用いた窒素追肥試験を行った。窒素追肥によって胚乳デンプンの鎖長が変化するがデンプン粒の形態までに影響するレベルでない、という前年度結果の再現性は確認できた。しかし、中村らの方法（2014）とHPLCによるデンプン鎖長解析では、デンプン鎖の分布変化に関する結果が異なっていた。また、中村らの方法による鎖長解析では、圃場試験で試験区間に有意な差が認められなかった。
H30に選抜した窒素応答型アミラーゼ(BAMY3、BAMY5、Amy3E)のゲノム編集3重破壊系統については、稔実率が非常に低く解析に必要な種子量が得られなかった。そこで、2重破壊系統(BAMY3、BAMY5）および3重破壊系統の再選抜を行なって目的系統を得た。
H30に作製したベータアミラーゼ3および5を認識する抗体は、種子の抽出タンパク質および胚乳の電子顕微鏡切片いずれにも特異的な反応が検出できず、再度の抗体作成が必要と考えられた。
機能解析用の組換え植物作製のために、発現解析用の9種のベータアミラーゼプロモーター断片（約2kbp）、過剰発現用のベータアミラーゼ3および5のコード領域断片（約2kbp）の取得をめざしたが、いずれもこの長さでのPCR増幅が困難で、R1年度内にベクター構築を終えられなかった。
当初予想と異なる結果が多く、当初計画よりは進行が遅れている。しかし、窒素追肥によってデンプン鎖構造が変化することは確実と見ており、また機能解析用の組換え植物については、当代種子の解析から得られる結果も多い。最終年度はデンプン鎖長解析と組換え植物解析に集中することで、窒素追肥・デンプン鎖長変化・ベータアミラーゼ群の相互の関係性について、一定の結論は得られると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
圃場および人工気象機を用いた窒素追肥試験から得られた種子について、胚乳デンプン鎖長解析およびデンプン粒観察を行う。同様に、アミラーゼ3重破壊系統等についても世代を進めて種子を増殖し、可能であれば同様の解析を行う。
発現解析用の9種のベータアミラーゼプロモーターGUS融合遺伝子導入したイネ、およびベータアミラーゼ3および5の過剰発現イネを作出し、特性解析を行う。
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| Causes of Carryover |
R1年度は、当初予想と異なる結果が多かったことや、種子増殖がうまくいかなかったことにより、進捗がやや遅れてその分の消耗品費がかからなかった。最終年度は、様々な組換えイネの作出や精密分析試験に消耗品費あるいは委託分析費がかかるため、次年度使用額はそれに充当する。
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