2019 Fiscal Year Research-status Report
Production of plant with high ascorbic acid contents by metabolic engineering
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18K05620
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
藤川 愉吉 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 講師 (10506687)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 共発現 / アスコルビン酸の強化 / 植物 / 局在解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では代謝工学によるアスコルビン酸(AsA)生合成酵素に着目して植物のAsA強化を目指している。これまでにトマト葉のプロトプラストを用い、６つのAsA生合成酵素のうち、上流３つの酵素（GDP-D-mannose pyrophosphorylase；GMP、GDP-D-mannose-3’,5’-epimerase；GMEおよびGGP）の共発現が、細胞内のAsA強化に重要であることを明らかにしている。そこで構成的発現によるAsA強化を評価するため、本年度は構成的高発現プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーターの下流に、それぞれアセロラ(Malpighia glabra L.)のMgGMP、MgGMEおよびMgGGP遺伝子を導入した発現カセットを持つ植物用の遺伝子発現ベクターを作製した。次いで、それぞれの遺伝子発現カセットをGateway Recycling Cloning法により単一の遺伝子発現ベクターにサブクローニングして、複数遺伝子の共発現用ベクターを作製した。さらに、アセロラMgGMPおよびMgGPP遺伝子プロモーターを利用した遺伝子発現カセットも作製している。
AsA生合成の最終酵素であるL-galactono-1,4-lactone dehydrogenase；GalLDH（GalLDH）はミトコンドリアに局在していることが知られている。そこで前年度にアセロラMgGalLDHに着目して作製したGFP融合MgGalLDH発現コンストラクトを用いて細胞内局在を確認した結果、ミトコンドリアでGFP蛍光シグナルを検出した。さらにMgGalLDHをN末端領域に着目して局在解析を行ったところ、MgGalLDHのN末端領域にミトコンドリア局在シグナルが存在することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物の植物におけるAsA生合成に最適な生合成酵素の組み合わせについて、トマトのプロトプラストを用いた一過的過剰発現系により決定している。今年度は組み合わせを決定した3つAsA生合成酵素に着目した。それら３つの生合成酵素を共発現させた遺伝子組換え植物作出のための植物発現ベクターを作製した。植物発現ベクターにCaMV35Sプロモーターをもつ遺伝子発現カセットをタンデムに連結させた場合、導入遺伝子が期待通りに発現しないことも予想される。そこで、CaMV35Sプロモーターをもつ遺伝子発現カセットだけでなく、アセロラMgGMPおよびMgGPP遺伝子プロモーターをもつ遺伝子発現カセットの作製も行っている。
細胞内におけるAsA生合成の場を検討するため、アセロラMgGalLDHの一次構造内にあるミトコンドリア局在シグナルを特定するために作製したGFP融合MgGalLDHをタマネギ表皮細胞で一過的に発現させ、ミトコンドリアの局在を確認した。さらにMgGalLDHのN末端領域に着目して、それらの変異体を作製し、ミトコンドリア局在シグナルがMgGalLDHのN末端領域に存在することも確認した。そのため、本研究は概ね計画通りに進展したものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
植物における複数のAsA生合成酵素の共発現を引き続き進める。これまでに３つの生合成酵素（MgGMP、MgGMEおよびMgGGP）を共発現させる植物発現ベクターを作製しているため、その遺伝子発現ベクターを用いて遺伝子組換え植物を作出する。対象とする植物は、応用研究を展開するためのトマトの他に、比較的短期間で遺伝子組換えが可能なシロイヌナズナも予定している。３つのAsA生合成酵素を共発現させたトマトについては、特に果実に着目して果実のサイズや成熟、AsA量の影響を評価する。シロイヌナズナでは葉のAsA量の影響だけでなく、環境ストレスなどに対する生育特性も評価する。
細胞内におけるAsA生合成の場も改変していくことも計画している。アセロラMgGalLDHのN末端領域にミトコンドリア局在シグナルが認められているため、その領域を欠失させたMgGalLDHを植物細胞内で過剰発現させ、AsA量と生育特性を評価する。
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| Causes of Carryover |
当初計画していたよりも物品費を安く抑えることができたため未使用額が発生したが、引き続き、次年度以降も物品購入に使用する
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Research Products
(2 results)
