Elucidation of QoI resistant mutation mechanism in rice blast fungus

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05640
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 曾根 輝雄 北海道大学, 農学研究院, 教授 (00333633)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阿部 歩 北海道大学, 農学研究院, 技術専門職員 (70374626)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 損傷乗り越え合成 / オルタナティブオキシダーゼ / ミトコンドリア / QoI剤 / eGFP / mitotracker

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，イネいもち病菌におけるストロビルリン系殺菌剤（QoI剤）耐性変異の発生，遺伝，蔓延のメカニズムを明らかにすることで，薬剤の導入→耐性菌の発生→新薬剤の導入の「いたちごっこ」からの脱却を目指すことを目的としている．
まず，mtDNA cytbコドン143変異の発生とDNA損傷乗り越え合成の関係の解析のため，いもち病菌のオルタナティブオキシダーゼの欠損株の作成を行った．2回相同組換えにより遺伝子の破壊を試みているが，破壊候補株の生育が芳しくなく，取得に至っていない．CRISPR-Cas9など，ゲノム編集を用いることでより効率的に得ることを検討したい．
一方で，プロトプラスト融合により得られた野生型ミトコンドリアと変異型ミトコンドリアの混在株は，分生子形成によりホモプラスミー化し，一方のミトコンドリアに大きく偏る傾向があることが明らかとなった．こちらに関しては，融合株をそのまま使用して数の変化が起こるかを検討したい．
また，ミトコンドリアの可視化のため，蛍光タンパク質による可視化を行った．ミトコンドリアに局在するタンパク質として，クエン酸シンターゼを用い，eGFP蛍光タンパク質をC末端に融合させたタンパク質をイネいもち病菌Ina86-137株にに発現させた．形質転換株のGFP蛍光とmitotrackerによるミトコンドリアの蛍光染色との比較により，GFPによりいもち病菌のミトコンドリアが可視化できたことがわかった．一方，分生子形成過程におけるミトコンドリアの定量のため，分生子形成初期のタイミングを検討し，培地上での分生子形成誘導処理後6時間後に初期分生子形成が見られることがわかった．今後は，分生子形成初期のミトコンドリアの定量を行い，どのようにミトコンドリアが伝播するかを明らかにしたい．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

オルタナティブオキシダーゼ欠損株が順調に得られていないこと，変異型と野生型ミトコンドリア量の変化の解析が進んでいないことなどから，やや遅れていると判断している．一方で，ミトコンドリアの可視化に関しては順調に進んでいる．

Strategy for Future Research Activity

オルタナティブオキシダーゼ欠損株の取得が困難な場合，没食子酸などの阻害剤を使用して実験することも検討したい．また，プロトプラスト融合株をそのまま使用して比率の変化を解析することも検討する．これらのアプローチにより当初目的を十分に達成出来ると考えている．

Causes of Carryover

年度末に成果発表のために旅費あるいは投稿費として使用する予定をしていたが，研究成果を蓄積してから発表した方がよいと判断したため，次年度使用額となった．次年度は成果発表を多くし，正しく使用する予定である．