2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of disease-resistant rice plants using epigenetic mutations and verification of their practical use
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18K05644
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
小林 一成 三重大学, 地域イノベーション推進機構, 教授 (90205451)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 病害抵抗性 / イネ / エピジェネティクス / DNAメチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、抵抗性獲得個体の全遺伝子発現解析およびエピジェネティック変異と相関する発現変化の特定のため、次世代シーケンサーを用いたRNA-seqにより、獲得個体の全遺伝子の発現を網羅的に検討し、いもち病抵抗性獲得と高い相関を示す遺伝子発現変化を特定した。また、バイサルファイト・次世代シーケンス法により、抵抗性獲得個体および対照個体の全ゲノムメチル化状態変化を検討し、RNA-seqの結果から抵抗性獲得に関与すると考えられる遺伝子のエピジェネティック変異の有無を検討した。今年度の研究から得られた主要な成果は以下の通りである。
（１）RNA-seq解析および全ゲノムメチル化解析の結果より、抵抗性獲得個体において有意な発現上昇が認められる304遺伝子のうち、256遺伝子（84.2%）にはプロモーター領域（転写開始点から1kb以内の領域）にメチル化変化は認められなかったが、30遺伝子（9.9%）のプロモーター領域に低メチル化変化、18遺伝子（5.9%）に高メチル化変化が確認された。
（２）抵抗性獲得個体で有意に発現上昇が認められるとともに、プロモーター領域に低メチル化変化が認められた30遺伝子について遺伝子オントロジーエンリッチメント解析した結果、response to stimulus、response to biotic stimulusおよびresponse to stressの生物的プロセスに関与する遺伝子が有意にエンリッチされていた。
（３）これらの結果から、本法で作出した抵抗性獲得イネのいもち病病抵抗性はエピジェネティック変異、特にプロモーター領域のDNAメチル化変化に起因することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、（１）我々が開発したエピジェネティック変異を方向づける方法で作出した抵抗性獲得イネのいもち病病抵抗性はエピジェネティック変異に起因するか、（２）エピジェネティックに変異した遺伝子のうち病害抵抗性プライミングに決定的な役割を果たす遺伝子は何か、および（３）作出したいもち病抵抗性イネは圃場において実用的な抵抗性を示すか、の3点を明らかにすることを目的としている。具体的には、研究期間中に、１）再生個体の全遺伝子発現解析およびエピジェネティック変異と相関する発現変化の特定、２）耐病性獲得イネ個体における全ゲノムメチル化状態とクロマチン修飾の解析、および３）いもち病激発圃場における耐病性獲得イネ個体の栽培による実用性の検証を計画している。
今年度は、研究計画のうち１）のRNA-seq解析および２）の次世代シーケンサーによる全ゲノムDNAメチル化解析を実施することにより、本法による病害抵抗性獲得に関与する候補遺伝子を明らかにできた。以上のことから、本研究は計画通り進捗しており、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、今年度実施したRNA-seq解析および次世代シーケンサーによる全ゲノムDNAメチル化解析について、系統数を増やして精度を高めるとともに系統間差異について検討する。また、ヒストン修飾についても解析を実施し、本法で作出した抵抗性獲得イネのいもち病病抵抗性がエピジェネティック変異に起因することの確実かつ最終的な証明を行うこととする。また、本法により１回のみ処理した抵抗性獲得系統において、潜在的に存在する全ての標的遺伝子にメチル化変化を引き起こしているか否かを明らかにする。さらに、メチル化変化により発現変化した遺伝子が、イネの病害抵抗性発現のマスターレギュレーターとして機能する可能性を明らかのするため、形質転換体を用いた接種実験を準備する。以上のことを明らかにするため、次年度は以下の実験を行う。
１）本法により作出された抵抗性獲得イネ系統にプロベナゾールを処理し、抵抗性がさらに上昇するか否かを検討する。また、サリチル酸を含む他の抵抗性誘導物質を用いても同様に抵抗性獲得イネを作出できるか否かを検討する。
２）RNA-seq解析および全ゲノムメチル化解析を複数の系統で実施し、系統間の差異があるか否かを明らかにする。
３）次世代シーケンサーを用いたChIP-seq解析により、いもち病抵抗性獲得イネ個体に特有のクロマチン修飾変化が認められるか否か明らかにし、RNA-seqの結果との相関を検討する。
４）RNA-seqおよび全ゲノムメチル化解析の結果、プロモーター領域のメチル化変化と発現変化に相関が見られた遺伝子のうち、転写因子やシグナル伝達経路に関与するものをマスターレギュレーターの候補遺伝子として抽出し、形質転換イネを作出する準備を行う。
また、本法に関する特許出願を次年度中に確実に実施し、最終年度には、いもち病激発圃場における試験を行うための条件を整える。
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| Causes of Carryover |
（理由）
全体額のうち、ごく少額が端数として生じたものである。
（使用計画）
少額のため、次年度には確実に使用する予定である。
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