枯草菌が生産する殺虫成分の構造と作用機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05649
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 西脇 寿 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (30508784)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 枯草菌 / 殺虫活性 / イエバエ / アカイエカ

Outline of Annual Research Achievements

これまでに農業害虫であるハスモンヨトウ幼虫に殺虫効果を示す菌株として，ひとに対する安全性の高い枯草菌を単離している。このような殺虫性細菌は将来の新規生物農薬として開発されることが期待できるものの、その安全性を示すためには殺虫成分を明らかにして、作用機構に関する知見を得ることが必要となる。本研究では、この殺虫性枯草菌が生産する殺虫成分を精製し，その構造ならびにコードする遺伝子配列を解明し，組換え体タンパク質を作成するとともに，殺虫スペクトルに関する知見を得ることを目的としている。これまでに，殺虫効果を示す枯草菌A1-3株の培養液から，衛生害虫であるアカイエカ幼虫とイエバエ成虫に対して殺虫効果を示す成分を単離し，本菌株が殺虫成分を複数生産していることを明らかにしてきた。
今年度は，それら殺虫成分の全体構造を明らかにすることを目指した。イエバエに殺虫活性を示した成分をSDS-PAGEにより分析することで低分子成分であることを確認した。トリプシンだけでなく，キモトリプシンでも分解されることを見出し，断片ペプチドを回収することができた。また，アカイエカに効果を示す候補タンパク質のアミノ酸配列を解析し，そのタンパク質をコードする遺伝子を明らかにした。大腸菌を用いて過剰発現させて活性を評価したが，活性は認められず，違う成分であることが考えられた。そこで，再精製を試みたところ，新たに数種の候補タンパク質を選抜することができた。
また、殺虫スペクトルの拡大を狙って、ミカンハモグリガなどの害虫に対する殺虫効果を評価したが、顕著な効果は認められなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2018年度，分子量の異なる殺虫成分が複数存在していることが明かになったが，2019年度は部分アミノ酸配列をもとに，それぞれの殺虫成分の全アミノ酸配列を明らかにすることを試みた。イエバエに殺虫効果を示すものに関しては，トリプシン消化で得られた断片だけでは全長がわからなかったため，他の酵素による消化を試みた。その結果として，数種のアミノ酸配列を得ることができたが，全長の解明には至っていない。一方，アカイエカ幼虫に対して殺虫効果を示すタンパク質に関しては昨年度明らかにした部分アミノ酸配列をもとにして，コードする遺伝子を明らかにすることができた。その結果をもとに，殺虫成分の過剰発現実験を実施したが，活性は認められず，異なる成分であることが考えられた。再精製を試みたところ，候補タンパク質を複数選抜することができた。さらに，この枯草菌の殺虫スペクトルの拡大を狙って柑橘の重要害虫であるミカンハモグリガに対する殺虫試験も試みたが，効果は認められなかった。
殺虫成分の全体構造を明らかにすることはできなかったが，再試験の結果として，新規アミノ酸配列を明かにすることができており，総合的にみると本研究は当初の計画どおりおおむね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

今後，過剰発現系により組換体タンパク質を調製し，本当に殺虫成分であるか確証を得ることが急務である。この組換え体タンパク質を調製した後は，部位特異的に変異を導入したものを複数調製し，殺虫効果を発揮するために必要な部分構造を明らかにすることを目指す。
イエバエに即効的な殺虫効果を示す成分の作用機構に関しては，細胞毒性ではないことが明かになっており，電気生理学的な試験を試みていきたい。2019年度に電気生理活性を評価する機器を少し揃えることができてきたので，今後電気生理活性の評価系を立ち上げていきたい。
また，殺虫スペクトルを明らかにするために，引き続き他の害虫に対する殺虫活性を評価するとともに，益虫に対する効果を評価していく。