FISH法によるタマネギべと病菌および乾腐病菌の検出

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05654
• Research Institution: Saga University
• Principal Investigator: 草場 基章 佐賀大学, 農学部, 准教授 (90304881)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: FISH / Peronospora / Fusarium / 卵胞子 / 厚膜胞子 / タマネギ

Outline of Annual Research Achievements

タマネギべと病菌(Peronospora destructor)とタマネギ乾腐病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cepa)はタマネギ栽培における重要病原菌として知られる。各菌はそれぞれ卵胞子（べと病菌）と厚膜胞子（乾腐病菌）を形成し、土壌中で耐久生存を行う。本研究ではrRNAを標的としたFISH法により生きた卵胞子および厚膜胞子を特異的に検出する手法を開発する。これにより、これら病原菌について土壌中の菌量を生菌ベースで把握するシステムを構築する。
本年度はFISHプローブの設計を計画した。タマネギべと病菌については当研究室で解読した18S rRNA遺伝子の塩基配列を標的とした。タマネギべと病菌が含まれるPeronosporaceae科の種との同塩基配列の比較から本菌特異的な多型を含む領域を検索した。その結果選ばれたそれぞれ20塩基からなる2つ領域をプローブ配列とした。タマネギ乾腐病菌は既報の28S rRNA遺伝子およびITS領域の塩基配列を標的とした。各種Fusarium属菌との同塩基配列の比較から本菌特異的な多型を含む領域を検索した。その結果、これら塩基配列から本菌特異的な多型を含む領域をそれぞれ一つ選ばれ（各20塩基）、プローブ配列とした。タマネギべと病菌については設計したプローブがハイブリダイズすることを分生胞子を用いることで確認した。タマネギ乾腐病菌についても分生胞子を用いて、プローブがハイブリダイズすることを現在、確認している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本本年度の研究実施計画はプローブ設計であり、タマネギべと病菌とタマネギ乾腐病菌のどちらについても、プローブの設計に成功した。そのため、研究計画に遅延は無いと判断された。

Strategy for Future Research Activity

本年度は設計したプローブを用いて卵胞子および厚膜胞子に対するFISHを行う。これら胞子にプローブをハイブリダイズさせるための条件を検討する。卵胞子と厚膜胞子は厚い疎水性の細胞壁に囲まれている。プローブの細胞壁透過性を高めるため、プローブには人工核酸であるPNAを持ちいることを検討する。また、通過したプローブが少量でも十分な蛍光が観察できるCRAD-FISH法やガラスビーズ等による細胞壁の物理的加傷も予定する。

Causes of Carryover

2018年2月に注文した試薬に国内在庫がなく、2019年4月まで購入できなかったため、次年度使用額が生じた。この次年度使用額は当該試薬の購入に充てる。