FISH法によるタマネギべと病菌および乾腐病菌の検出

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05654
• Research Institution: Saga University
• Principal Investigator: 草場 基章 佐賀大学, 農学部, 准教授 (90304881)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: FISH / PNA / タマネギべと病菌 / タマネギ乾腐病菌

Outline of Annual Research Achievements

タマネギべと病菌(Peronospora destructor)とタマネギ乾腐病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cepa)はタマネギ栽培における重要病原菌として知られる。各菌はそれぞれ卵胞子（べと病菌）と厚膜胞子（乾腐病菌）を形成し、土壌中で耐久生存を行う。本研究ではrRNAを標的としたFISH法により生きた卵胞子および厚膜胞子を特異的に検出する手法を開発する。これにより、これら病原菌について土壌中の菌量を生菌ベースで把握するシステムを構築する。
本年度は前年度に確立したハイブリダイゼーション条件および、28S rRNAおよびrRNA-ITS領域を標的として設計した人工核酸（PNA）プローブを用いてタマネギべと病菌の卵胞子および乾腐病菌の厚膜胞子に対してFISH法による蛍光染色を行うことを予定した。べと病菌の卵胞子については、気象条件により本年度はべと病が極めて少発生となったため、実験に使用するために充分な卵胞子が採集できなかった。そのため、検討があまり進まなかった。また、卵胞子は予想外に休眠が深く、rRNAの発現量が極めて少ないことが明らかとなった。そのため、蛍光発光が弱くなる問題点が生じた。また、乾腐病菌の厚膜胞子についても同様に休眠が深く、rRNAの発現量が極めて少ないため蛍光発光が弱くなる問題点が生じた。そこで、土壌から抽出した厚膜胞子の培養により発芽を促すことで、rRNAの発現量を向上させることを検討した。一方、前年度設計したプローブについてはハイブリダイゼーション効率が低いことが判明し、再設計を行った。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

上述の通り、タマネギべと病菌については充分な卵胞子が採集できず、検討が進まなかった。さらに、rRNAの発現量が少なく、蛍光発光が弱くなるといった問題が生じた。また、タマネギ乾腐病菌についてはプローブを再設計したが、緊急事態宣言等により合成・納品が遅くなり、充分な検討ができなかった。

Strategy for Future Research Activity

本年度はタマネギべと病菌と乾腐病菌のどちらについても昨年度に充分な検討ができなかったFISH法による蛍光染色を続けることを予定する。また、どちらの菌についてもrRNAの蛍光発色が弱い問題点が生じている。そこで、FISH法を一部改変したIn situ PCR法も蛍光染色に取り入れる。

Causes of Carryover

気象の影響により研究遂行のための十分な実験材料（卵胞子）が得られなかったこと、さらには、緊急事態宣言等により注文していた試薬（PNAプローブ）の納品に遅れが生じ、研究遂行が不可能になったこと。これらのことより、研究期間を延長したため、次年度使用額が生じた