FISH法によるタマネギべと病菌および乾腐病菌の検出

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05654
• Research Institution: Saga University
• Principal Investigator: 草場 基章 佐賀大学, 農学部, 准教授 (90304881)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: FISH / タマネギべと病菌 / タマネギ乾燥腐病菌

Outline of Annual Research Achievements

タマネギべと病菌(Peronospora destructor)とタマネギ乾腐病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cepa)は西日本の主要タマネギ生産地において激しい被害をもたらしている。両菌とも土壌伝染性の植物病原菌であり、土壌中の伝染源はそれぞれ卵胞子（べと病菌）と厚膜胞子（乾腐病菌）であることが知られている。本研究ではrRNAを標的としたFISH法により生きた卵胞子および厚膜胞子を特異的に検出する手法を開発する。これにより、これら病原菌について土壌中の伝染源量を生菌ベースで把握するシステムを構築する。これまで本研究では28S rRNAおよびrRNA-ITS領域を標的として設計した人工核酸（PNA）プローブの設計、これらプローブのハイブリダイゼーション条件の確立を行った。さらに、これらプローブをを用いたFISH法によりタマネギの植物体から両菌の特異的検出に成功した。一方、卵胞子および厚膜胞子に対するFISH法ではプローブのハイブリダイゼーションにより十分な強度の蛍光発色が得られなかった。これは両胞子の休眠が予想外に深く、rRNAの発現量が極めて少ないためと考えられた。そこで、本年度はタマネギべと病菌の卵胞子を対象としてIn situ LAMP法による検出を試みた。本法はIn situ PCR法の変法でありDNAを鋳型として生体内で標的遺伝領域のDNA断片の増幅を行う。このDNA断片をFISH法によるハイブリダイゼーションにより検出する。標的遺伝領域としては18S rRNA遺伝子ならびにITS領域を選択したが卵胞子からは充分な蛍光発色は得られなかった。これはLAMPプライマーの卵胞子細胞壁への透過性が低かったためと考えられた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

上述の通り、LAMPプライマーの卵胞子細胞壁への透過性が低いといった技術上の問題点に直面した。この問題を解決するためにさらなる検討を試みたが、新型コロナウイルスの感染拡大の影響により必要な試薬の購入に遅延が生じてしまい、予定通りの実験計画の遂行が困難となった。

Strategy for Future Research Activity

本年度はLAMP法よりも分子量の少ないプライマーの使用が可能となるIn situ PCR法を取り入れた蛍光染色に主に取り組む。これと併せて、酵素処理・ビーズ破砕を組み合わせることにより細胞壁透過処理の改良を試みる。

Causes of Carryover

上述の通り、新型コロナウイルスの感染拡大の影響により必要な試薬の購入に遅延が生じてしまい、予定通りの実験計画の遂行が困難となったため、次年度使用額が生じた。