難防除植物RNAウイルスの伝搬機構の解明と感染系の確立

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05661
• Research Institution: Iwate Biotechnology Research Center
• Principal Investigator: 藤崎 恒喜 公益財団法人岩手生物工学研究センター, 園芸資源研究部, 主任研究員 (30626510)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清水 元樹 公益財団法人岩手生物工学研究センター, ゲノム育種研究部, 研究員 (90734343)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 土壌伝搬 / 土壌細菌 / メタゲノム / 弱毒株

Outline of Annual Research Achievements

リンドウこぶ症の病原体と考えられているGKaVの感染経路特定と人工接種系の確立に向けて、これまで得られた土壌伝搬性の再現性試験を行った。野外のこぶ症発症圃場から採集された土壌に複数品種のリンドウ苗を植え、温室管理下で今冬に越冬させた。本年度はそれらリンドウ株の越冬後のこぶ症発症について調査予定である。
また、以前にGKaVが土壌細菌から検出された結果を受け、こぶ症発症圃場の土壌および越冬芽から細菌相の調査を行なった。メタゲノム解析の結果、こぶ症株で存在比が上がっている候補菌株が少なくとも２０種以上同定された。また、越冬芽もしくは土壌から単離された1000菌株以上のバクテリアについてGKaV検出を行い、Pseudomonas属菌やBurkholderia属菌等がこぶ症株で存在比が上がっていること、そのうちいくつかの菌株でGKaVが検出されることがわかった。これらの菌株を継代・培養後、培養リンドウ組織に接触させたがこぶ症発症とGKaV感染を再現するには至っていない。こぶ症発症圃場の土壌を用いたこぶ症発症試験では越冬後の株で初めて症状が認められたため、H30年度は同定した菌株についてもリンドウ苗に浸潤させ、土壌試験と同様に温室管理下で今冬に越冬させた。越冬後のこぶ症発症について調査予定である。
並行して、弱毒形質を持つGKaVもしくはこぶ症耐性を持つリンドウ組織の単離を目指し、野外圃場からのGKaVが感染しているが症状が認められないリンドウ株（２品種）を10株同定し、収集を行なった。さらにこぶ症リンドウの培養組織からGKaVが感染しているが生育阻害が緩和しているリンドウ組織の選抜を実験室レベルで行い、現在候補株を１系統単離した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画通り、GKaVの土壌伝搬性の再現性試験及びこぶ症発症株の越冬芽ならびにその周辺土壌の生物相の解析を行った。メタゲノム解析の結果、複数の細菌種でこぶ症発症株での存在比が増大していることが示唆されたほか、単離した1000菌株以上の細菌の解析から、Pseudomonas属菌、Burkholderia属菌を中心にこぶ症株での存在比の増大が確認され、そのうちいくつかの菌株ではGKaVが検出された。当該細菌を培養リンドウに接触させる感染実験を試みたが、こぶ症の発症とGKaV感染を確認するには至っていない。感染実験の条件検討が必要となっている。
また、GKaV弱毒候補株もしくはこぶ症耐性リンドウの探索と作出を試み、野外圃場のこぶ症発症圃場からGKaVが感染しているが症状が緩和しているリンドウ株を10株以上同定し収集した。加えて実験室内でこぶ症の培養リンドウ株を継代維持している過程で生じる生育阻害緩和株に着目し、選抜した。単離した15系統のうち14系統はエスケープによりGKaV感染が認められなかったが、１系統はGKaVが感染しているにもかかわらず地上部の生育が良い系統（AS24）であった。AS24は症状は緩和しているが、健全株と比べると生育阻害やこぶ症状がいまだ認められるため、継続的な選抜を行なっている。

Strategy for Future Research Activity

こぶ症発症圃場の土壌を用いた土壌伝搬試験については、これまでの発症が越冬後の苗であったことを考慮し、越冬後に感染調査を行う。合わせて、各種土壌細菌、罹病株破砕液を用いた感染実験についても、越冬芽の使用、低温処理の影響などを視野に入れて条件検討を行う。
こぶ症罹病株および発症圃場の土壌における生物相の解析については、一定の結果が得られたため、本年度はサンプル数を増やし、各サンプル間での特異性、共通性に関するデータの取得を目指す。
野外から収集したこぶ症緩和リンドウ候補株については、その症状とGKaV感染の経年的な変化を調査するとともに、培養リンドウを用いたこぶ症緩和リンドウ株の実験室内での選抜を引き続き行う。すでに選抜されたこぶ症緩和リンドウ株（AS24）は、より症状が緩和した株の作出するための母本として用いる。本実験は培養時に自然に生じる培養変異に依存し、時間がかかるため、変異導入薬剤の利用を視野に入れ、研究の促進を図る。

Causes of Carryover

一部ウイルス検定を安価な酵素で代用した。次年度以降における圃場サンプルの収集と解析のための人件費および消耗品費に当てる予定。