Identification of the interactinng proteins to clarify the molecular function of a virulence factor, Rbf1, in the rice blast fungus

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05664
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 西澤 洋子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, ユニット長 (40355756)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: イネ / いもち病 / 病原性 / 感染機構

Outline of Annual Research Achievements

Rbf1タンパク質をイネの細胞間隙、あるいは細胞質に蓄積させるためのベクターで形質転換した以下の３種類の組換えイネを作出した。Pubi-Aイネ：トウモロコシユビキチンプロモーター（Pubi)＋コドン使用頻度をイネ用に改変したRBF1翻訳領域＋HA-tag (OsRBF1-HA) 、Pubi-Bイネ：Pubi＋分泌シグナル配列を欠損させたOsRBF1にHA-tagと付けたもの (OsRBF1-ss)、PubiCイネ：Pubi＋イネキチナーゼシグナル配列を繋いだOsRBF1-ss＋HA-tag。
導入遺伝子の発現を解析した結果、転写レベルでは高発現する系統が得られたが、抗HA抗体あるいは抗Rbf1抗体によるウェスタン分析ではいずれのイネ系統においてもタンパク質の蓄積が認められなかった。Pubi-AイネとPubi-Bイネについては正常に生育し、自殖次世代種子が得られた。一方、Pubi-Cイネのほとんどの系統は矮性で稔実性が著しく悪かったため、形質転換実験を再試しているところである。
Pubi-AおよびPubi-BイネのT1世代植物の葉身を用いていもち病抵抗性を評価した。その結果、Pubi-AイネにおいてΔrbf1株の感染亢進が認められたため、Rbf1はイネの細胞間隙で機能する可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

イネにおけるRbf1タンパク質の蓄積を検出するために解析法をいろいろ検討したため、また、１系統において形質転換イネの生育が阻害され、必要量の次世代種子が得られなかったため、その先の研究計画を実行できなかった。

Strategy for Future Research Activity

Δrbf1株を用いた感染実験の追試を行い、Rbf1がイネの細胞膜外で機能する可能性を示す。また、BICマーカー遺伝子を導入したいもち病菌株を用いて、BIC形態を蛍光観察する。さらに、MAMPs処理後の免疫応答を比較解析することで、Rbf1が宿主免疫抑制機能を発揮する部位がイネの細胞内なのか細胞外なのかを明らかにする。

Causes of Carryover

想定していた結果が得られなかったため、年度内に実行できなかった実験があった。その分の消耗品代と人件費を次年度に使用する。