2019 Fiscal Year Research-status Report
Neurogenic control of PTTH cells during insect development.
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18K05674
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
岩見 雅史 金沢大学, 生命理工学系, 教授 (40193768)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木矢 剛智 金沢大学, 生命理工学系, 准教授 (90532309)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | カイコガ / 発生・分化 / 脱皮・変態 / ホルモン / 神経分泌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昆虫の幼虫は各齢において十分なサイズに達してから次の齢へと脱皮・変態し，栄養不足などにより成長が遅れた場合には脱皮のタイミングも遅延する。しかしながら，発生のタイミングが内外の環境によって適応的に制御される機構の全貌は未だに不明のままである。本研究は，昆虫の発生タイミングが個体の内外の環境に対して適応的に制御される仕組みを，PTTH細胞の生理特性の変化に着目して解き明かすことを目的としている。
今年度はPTTH細胞の神経活動を制御するシグナル因子の遺伝学的解析を行った。当グループは以前にシングルセルRNA-Seqを行い，PTTH細胞選択的PDF受容体が発現していることを見出していた。また一昨年度の解析より，PTTH細胞は朝に良く活動し，夕方には活動が低下するといった概日制御があることを見出していていた。PDFは朝を知らせるシグナル因子であることがショウジョウバエを用いた研究で明らかとなっていたことから，PTTH細胞の活動性をPDFが概日制御すると仮説を立て研究を進めた。
本仮説の検討を目的に， PDFおよびPDF受容体のノックアウト系統のCRISPR/Cas9による作出を試みた。PDFのノックアウトは作出に成功したが，PDF受容体はmRNAに脳特異的なスプライシングフォームがあることやデータベース上でゲノム解読が不十分な領域が含まれることから，ノックアウト系統を作出することはできなかった。
PDFノックアウトのホモ系統は生存可能で，脱皮回数の減少などの大きな発生プログラムの障害は認められなかった。しかし発生を詳細に解析したところ，野生型と比較して，幼虫の途中で脱皮タイミングが少しずつ遅延し，結果的に羽化が数日遅延するという表現型があることを見出した。この結果はPDFを介したシグナル経路が発生タイミングの制御に何か知らの役割を持つことを強く示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の最大目標であるPTTH細胞の神経活動を制御するシグナル系としてPDFを候補として同定し，PDFシグナル経路のノックアウトによって仮説の検証を試みた。その結果，PDFノックアウト系統を作出することに成功し，その解析によって発生遅延が起こることを見出した。これらの結果は，PDFを介したシグナル経路が発生タイミングの制御に重要な役割を果たすことを示しており，我々の仮説を支持するものである。以上の点から、研究はおおむね順調に進捗していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
PDFノックアウトにより幼虫時の脱皮タイミングが少しずつ遅延することで，結果的に成虫の羽化タイミングが遅延することを見出したが，これが脳のPTTH細胞を介しているのかについては不明である。よってPDFノックアウトの遺伝学的背景において，PTTH細胞特異的にGCaMP6fを発現する系統を作出し，PTTH細胞の神経活動の概日リズムが失われるかどうかを検討する。また最近，Cas13dを用いることで任意の細胞においてmRNAを効率的にノックダウンできる手法を確立したので，PTTH細胞特異的にPDF受容体の発現を抑制した系統を作出することで，上記仮説の検討を行えると考えられる。よって次年度はこれらの系統の作出・樹立することを目指す。
また今年度は光及び化学遺伝学的手法（チャネルロドプシンやDREADD）によってPTTH細胞の神経活動を任意のタイミングで制御することが出来る系統を作出し，その有用性を検討した。現在はその解析の途中である為，今後は引き続きこの解析を進め，幼虫の様々な時期にPTTH細胞の神経活動を活性化や抑制した際の血中エクジソン濃度や発生タイミングに与える影響を調べる。また，絶食や栄養素制限食などによる栄養状態の操作と組み合わせ，適応的な脱皮タイミング制御に及ぼす影響を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの蔓延により，予定していた学会発表が開催中止となったことや，カイコの飼育に必要な餌やジェノタイピングに用いる試薬を節約するなどした結果，少額の次年度使用が発生した。これは予想外の出来事による旅費の余剰や，餌や試薬の購入タイミングによるものである。次年度の予算と合わせて計画通り使用する予定である。
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