2019 Fiscal Year Research-status Report
新規な殺蚊Cry46Abトキシンの作用機構とトキシン間シナジー効果の解明
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18K05675
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
早川 徹 岡山大学, ヘルスシステム統合科学研究科, 助教 (30313555)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Bacillus thuringiensis / Mosquito larvae / Cry46Ab toxin / Channel解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Cry46Abはアカイエカ幼虫に殺虫活性を示す新しいCryトキシンである。Cry46Abの構造(アエロリシン型)は既知の多くのCryトキシン(３ドメイン型、全体の90%を占める)と大きく異なり、新しい蚊防除資材としての利用が期待されている。前年度までの解析からCry46Abが標的細胞膜上にカチオン選択的な小孔を形成するトキシンであることを明らかにしている (Sakakibara et al., 2019)。
本年度はまずCry46Abが形成する小孔の性質、特にイオン選択性をコントロールする技術の開発を進めた。構造の比較解析から推定されるCry46Abの膜貫入部位(β8-β9)には正の電荷を持つリジンが2つ(K155とK156)と負の電荷を持つグルタミン酸が2つ(E159とE163)が存在し、小孔のイオン透過性を制御している可能性を考えた。これらアミノ酸残基を反対の電荷を持つアミノ酸残基に置換した変異体を構築して解析した結果、変異体K155Eにおいてカチオン選択性と殺虫活性の上昇、E159K及びE163Kにおいてカチオン選択性と殺虫活性の減少が観察された。このことは小孔内部に露出する荷電性アミノ酸残基が小孔内のカチオン透過性を制御し、内部をアニオン優性にすることでカチオン選択性と殺虫活性が共に上昇することを示唆していた。
またCry4Aaや4Ba、11Aa、11BaなどCry46Abとは構造が異なる(３ドメイン型)殺蚊Cryトキシンについても電気生理学的な解析を進めた結果、これら全てがカチオン選択的な小孔を形成していた。殺蚊活性、場合によっては殺虫活性を示すCryトキシン全体の特徴として、カチオン選択的な小孔の形成があるのかもしれない。また異なるカチオン間の選択性はトキシンの種類によって異なっていた。カチオン間の選択性が殺虫活性と相関する可能性も考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は①Cry46Abが形成する小孔の性質、特にイオン選択性をコントロールする技術の開発と②3種類の殺蚊Cryトキシン(Cry4Aa及び11Aa, 11Ba)について小孔の性質を明らかにすることを目標に研究を進めた。上記概要に記述した通り、両課題において研究の大きな進展を得ることができ、研究はおおむね順調に進展していると言える。課題②においてデータとして不十分な部分(トキシンが形成する小孔のイオン選択性決定に関する解析の正確性及び回数など)もあるが、次年度中には確定したデータが得られる体制が整っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
小孔形成領域を標的とした変異導入によるCry46Abトキシンの改良。これまでの成果としてCry46Abが人工平面膜上にカチオン選択的な小孔を形成することが明らかになった。また小孔形成領域に位置するアミノ酸残基、特にK155を標的とした変異導入によって、小孔のカチオン選択性が増加、殺虫活性も上昇することが明らかになった。本年度はこれらの結果を基に、K155近傍のアミノ酸残基を標的とした変異体ライブラリーを構築、殺虫活性をさらに増強した変異体が構築できないか試みる。殺虫活性と相関する因子、及び活性に直接関与するアミノ酸配列(ホットスポット)の特定を試みる。
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| Causes of Carryover |
上述のように研究はおおむね順調に進んでいる。しかし一部組換えトキシンの生産・調製において、収量が低下する問題が生じ、その結果としてCry4Aa及び4Ba、11Aa, 11Baが形成する小孔の電気生理学的な解析データを確定するに至っていない。本年度の残額はこれら殺蚊Cryトキシンの電気生理学的解析データの補完及び確定に必要な消耗品を購うために使用する。
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