Establishment of cryopreservation method for plant and microorganism using two members culture

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05697
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 田中 大介 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 遺伝資源センター, 研究員 (60425593)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 二員ガラス化法 / 超低温保存 / フタバネゼニゴケ / アーバスキュラー / 遺伝資源 / ガラス化

Outline of Annual Research Achievements

近年，持続的農業環境と生態系の保全をする上で，植物と共生する生物（微生物）の存在が非常に重要になっている．しかし，それらの生物種は宿主である農業生物（植物）と二員でなければ生存することができず，凍結保存が困難である．一方，乾燥種子で保存できない難貯蔵性植物遺伝資源は、液体窒素で急速冷却するガラス化法が研究開発され半永久的な保全技術が確立されつつある．そこで，本研究では二員培養を元に新規超低温保存法「二員ガラス化法」の開発に着手し，地域や種ごとに異なる農業生物本来の姿を生物遺伝資源として保存し，必要時に宿主ごと融解，再培養，増殖する画期的なシステムの開発を目的に研究をおこなう．
本研究課題の特徴は，植物組織細胞に共生微生物を接種し二員培養を行った後に，難貯蔵性微生物ごとガラス化処理して超低温保存する技術開発をすることである．アーバスキュラー菌根菌などと共生関係を結ぶゼニゴケの仲間であるフタバネゼニゴケをホストとして利用し、絶対寄生菌の保存技術の開発を行う．ホスト材料のフタバネゼニゴケは一菌糸に由来するアーバスキュラー菌根菌の菌糸を単離できる．
フタバネゼニゴケの脱水耐性付与処理および脱水処理の検討を行い，熱伝導率の高い金属製デバイスを用いて急速冷却し超低温保存した結果，ゼニゴケで開発した方法を用いて液体窒素保存し高い生存率が得られた．現在，フタバネゼニゴケにアーバスキュラー菌根菌を接種した二員培養を行い．実践的な保存に取り組んでいる．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

一般的に，ガラス化法では組織細胞を常温から一気に超急速冷却することにより致死的な細胞内凍結なしにガラス化させることが可能である。上記機序が超低温保存の生存性に重要であり，微生物の保存法として一般的に用いられる緩慢凍結法と大きく違う点である．2018年度は，研究材料の調整と保存対象植物の超低温保存の予備実験を行った. 屋外に生息するフタバネゼニゴケ無性芽を採取し保存実験に供試した． Tanaka et al. (2016)が，ゼニゴケで開発した熱伝導率の高い金属製デバイスを用いて（冷却速度を速めてガラス化させる有効な手段）技術開発した結果，液体窒素保存処理区において高い生存率で成功した．さらに，屋外で採取したフタバネゼニゴケ葉状体の液体窒素保存にも成功した．しかし、このガラス化液を用いる方法は，グリセロールや糖類を大量に用いるため試料によっては雑菌混入による成育阻害が大きな課題になることが懸念される．そこで，無菌化したフタバネゼニゴケ培養体を作成し，無菌フタバネゼニゴケ無性芽を作成している．現在，アーバスキュラー菌根菌を含有する少量の土壌を滅菌した土壌に添加して共生植物（バヒアグラス，クローバー）と二員で培養する実験系の確立を進めている．これにより材料の違いによる失敗リスクを軽減する手法開発を目指す．
屋外のコケ類を胞子以外の組織から無菌化した培養体を簡便に作出する手法の開発も成果にあげられる．

Strategy for Future Research Activity

近々，アーバスキュラー菌根菌の二員超低温保存法が開発される見込みである．超低温保存した植物細胞およびアーバスキュラー菌根菌の細胞内微細構造や水の挙動を明らかにし，その知見を活用して，植物細胞と微生物細胞が両者とも細胞内凍結あるいは脱水傷害を受けない処理条件による高品質で安定した技術および新規専用ガラス化液を開発する．
具体的には液体窒素保存時および超低温保存過程の各ステップにおける細胞微細構造を電子顕微鏡によって観察し，細胞の反応と水の挙動（氷晶，ガラス化など）の関連を調べ，保存技術を確立する．また，凍結ステージと共焦点レーザー顕微鏡を組み合わせて，脱水に伴う植物細胞微細構造および細胞内の水の挙動を解析する．さらに，共生微生物の挙動と脱水した水の動きの関係性から最適化（最適な凍結保護剤の選定と最適処理濃度を検討）する.
最終年度までに農林水産ジーンバンク事業で維持しているアーバスキュラー遺伝資源の多様性を利用し、保存技術の汎用性を確認する．さらに，子嚢菌に二員超低温保存法が利用できるか確認する．
超低温保存技術を開発・整備することは実験途上の貴重な生物資源を研究基盤として保存技術で支援することにつながる．また，抵抗性検定のための菌株が超低温保存できることは、今後の抵抗性品種作出あるいはレース（菌株）の分布調査の上で，植物病理および作物育種の発展に寄与する．また，上記材料等を供試し超低温保存が容易かつ共生関係を構築できる植物遺伝資源の探索と適性評価を行う．
同時にホスト自体の超低温保存技術は，自然界に生息するコケ類の多様性保全という視点で培養・保存技術として提案出来るよう検討する。

Causes of Carryover

当初予定していたクリーンベンチよりも安価なクリーンベンチに変更した．また，屋外で採集した植物材料（フタバネゼニゴケ）の無菌化や材料調整に時間がかかり，予定していた実験の実施が難しかった．そのため、実験補助員の雇用を延期し人件費分を次年度使用することとした．次年度使用計画としては，上記の使用額を人件費に充て，精力的に実験を実施して早期に研究成果を上げる努力をする．