サカキ輪紋葉枯病菌の分類学的な検討と病理学的特性の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05746
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 木原 淳一 島根大学, 学術研究院環境システム科学系, 教授 (40294368)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 陶山 大志 島根県中山間地域研究センター, 森林保護育成科, 専門研究員 (20502892)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 輪紋葉枯病 / 繁殖体 / 分類 / 病害防除 / 植物病原糸状菌 / 紫外線

Outline of Annual Research Achievements

モッコク科サカキ属の常緑小高木であるサカキ（榊）は、葉物としてのニーズが高く、近年、中山間地域でのサカキ栽培が広がっている一方で、サカキ輪紋葉枯病による被害が問題となっている。しかしながら、本病の原因となるサカキ輪紋葉枯病菌には、未だ種名がなく、その生活環や病理学的特性に不明な点が多いことが障壁となり、効率的な病害防除対策が確立していない。本研究では、「種分類」・「生活環」・「病理学的特性」に焦点をあてた基礎研究をとおして、サカキ輪紋葉枯病の実用的かつ効率的な防除への応用研究に展開していくことを目的とした。
「種分類」では、サカキ輪紋葉枯病菌の分類学的な位置付けを検討するため、前年度のrDNA遺伝子の分子系統解析に加え、新たに、G3PDH、TEF、Tubulin遺伝子を用いた分子系統解析を行なった。その結果、サカキ輪紋葉枯病菌は、キンカクキン科に分類され、既知の近縁な糸状菌とは異なる系統群であったことから、新種である可能性が示唆された。
次に「生活環」では、サカキ輪紋葉枯病菌のジェネット分布を明らかにするため、マイクロサテライト（SSR）マーカー作成の検討を行なった。サカキ輪紋葉枯病菌を用いて、（AC）10または（GA）10をターゲットとした候補遺伝子領域を16遺伝子スクリーニングし、そのうち4遺伝子については、SSRマーカーを増幅できるプライマーを作成することができた。また、すでにサカキ輪紋葉枯病菌を高感度で特異的に検出するために確立したLAMP法を用いて、人工接種により形成された罹病葉や、落葉・堆積した罹病葉の菌核から、サカキ輪紋葉枯病菌を検出できることを明らかにした。
「病理学的特性」では、罹病葉における繁殖体の経時的な形成過程の観察を行なった結果、実体顕微鏡を用いて繁殖体形成過程の連続写真を撮影できた。また、繁殖体の断面を光学顕微鏡で観察することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

全体的に、それぞれの項目において、概ね順調に推移しているものの、再現性やデータ量、および、実験精度において不十分な点がいくつかあるため、これらの充実を図る必要がある。
「種分類」については、rDNA遺伝子に加えてG3PDH、TEF、Tubulin遺伝子のシークエンスデータを得ることができた。分子系統樹については、さらに検討を進める必要がある。分子系統解析の結果から、新種である可能性が高いため、繁殖体の形態的特徴については、引き続き、顕微鏡観察を中心とした形態観察を重点的に行なう予定である。子のう盤の観察については、越冬したサカキ罹病葉の菌核から実験室においても子のう盤が形成されることを確認した。
「生活環」については、ジェネット分布を明らかにするため、マイクロサテライト（SSR）マーカーを作成した。今後、任意のサカキ栽培園からサカキ輪紋葉枯病菌を分離し、マイクロサテライト（SSR）マーカーの有効性を検討したい。また、LAMP法については、さらに、実験室内での詳細な条件検討を行ない、その成果を論文としてまとめたいと考えている。
「病理学的特性」については、室内環境における病斑や繁殖体形成の方法については、ある程度、目処がたった。また、紫外線が繁殖体形成に重要であることが明らかとなったが、この点について、さらに、実験が必要と考える。一方、ヤブツバキやチャにおいても、輪紋葉枯病と思われる病徴を確認したことから、病原菌を分離するとともに、繁殖体の形態や各種遺伝子の塩基配列の相違などをサカキ輪紋葉枯病菌と比較する予定である。

Strategy for Future Research Activity

「種分類」については、各シークエンスデータのDNAデータベースへの登録を行なっていきたい。分子系統解析についても、他の植物の輪紋葉枯病菌と比較し、俯瞰的な分子系統解析を行なう予定である。繁殖体の形態的特徴については、さらにデータを充実させる。
「生活環」については、新種記載のため、各種形態の数値データの蓄積を引き続き行なう。マイクロサテライトマーカーによるジェネット分布の解析のため、サカキ輪紋葉枯病菌を分離するとともに、菌株間で多型が見られるかを早期に調査する。そのために、分離菌ではなく、繁殖体からDNAを抽出して実験に供試することを考えている。また、これまでの研究で確立したLAMP法による遺伝子検出法を用いて、罹病葉以外のサンプルにおいて、サカキ輪紋葉枯病菌が検出できるか否かについての調査を引き続き行なう。
「病理学的特性」については、室内環境において、恒常的かつ人為的に病斑を形成させ、繁殖体形成に及ぼす光の影響について調査を行なう。また、繁殖体形成を抑制するための方法として、光または殺菌剤の影響を調査する。引き続き、定期的な圃場調査を行なっていく。一方、ヤブツバキやチャにおいても、輪紋葉枯病と思われる病徴を確認したことから、病原菌を分離するとともに、繁殖体の形態や各種遺伝子の塩基配列の相違などをサカキ輪紋葉枯病菌と比較する予定である。

Causes of Carryover

学会での発表を行わなかったこと、前年度に購入した実験試薬や器具などのストックがあったため、当該年度の支出が抑えられた。翌年度分として請求した助成金と合わせ、シークエンス解析や学会発表、論文投稿などの執行を予定している。