光・電子相関顕微鏡法による木材細胞壁多糖類の網羅的局在解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05760
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 粟野 達也 京都大学, 農学研究科, 助教 (40324660)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 放射柔細胞 / プロテクティブレイヤー / 接触細胞 / 隔離細胞 / ペクチン

Outline of Annual Research Achievements

広葉樹材の放射柔細胞は他の構成要素とは異なる機能を有しており、細胞壁の構造や組成が異なる。リグニンおよび多糖類分布の報告はあるが、個々の非セルロース性多糖類や糖タンパク質の分布は明らかではない。そこで、免疫標識法を用いて放射柔細胞壁での非セルロース性多糖類の分布を観察した。
イタリアポプラの胸高部より採取した正常材前年輪部を化学固定後、樹脂包埋した。超ミクロトームを用いて木口面および板目面準超薄切片を作製した。38種のモノクローナル抗体による免疫蛍光標識を行い、蛍光顕微鏡で観察した。
ペクチンに関しては、アラビナン、アラビノガラクタンおよびラムノガラクツロナンIの標識が細胞壁最内層と壁孔膜に見られた。ラムノガラクツロナンIの標識は年輪前半で標識が強かった。一方、ホモガラクツロナンの標識は年輪前半で標識が弱かった。このことから、年輪内で不均一なペクチン分布が示唆された。ペクチンおよび糖タンパク質の標識強度は柔細胞ごとに違いが見られた。道管との間に壁孔を観察できた柔細胞では、全細胞で標識強度は同程度であった。壁孔が観察できなかった柔細胞の一部では、壁孔が観察できた柔細胞より標識強度が弱かった。壁孔が観察できた細胞は接触細胞であるが、壁孔が観察できなかった細胞は接触細胞か隔離細胞のいずれかである。細胞壁最内層におけるペクチンおよび糖タンパク質は接触細胞に存在するプロテクティブレイヤーと関係がある。
ヘミセルロースに関しては、キシラン、マンナンの標識が二次壁で見られた。一方、キシログルカンの標識は複合細胞間層と壁孔膜部に見られた。ヘミセルロースの標識強度は放射柔細胞間で違いがなかった。
ヘミセルロース標識の分布は木部繊維と共通しているが、ペクチンおよび糖タンパク質標識の分布は木部繊維と異なっており、ペクチンおよび糖タンパク質は放射柔細胞の機能と何か関係があると考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

光・電子相関顕微鏡法を木材試料に適用するため、試料調製法および電界放出走査電子顕微鏡（FESEM）の観察条件の検討を行った。
多数の免疫標識切片を網羅的に観察することを目的に、スライドガラスをマクロプレートシステムで使用するためのアダプタを試作した。スライドガラス１枚を装着できる24穴プレートでは問題なく使用できたが、スライドガラス4枚を装着でき自動洗浄機に対応した96穴プレートでは液漏れが発生し、免疫標識に使用することができなかった。
FESEM観察条件の検討では、ワーキングディスタンスを2mm以下に減じるとともに、加速電圧を 5-7kVとし、プローブ電流量を増加させると反射電子像の像質が向上することが分かった。
試料調製については、イオンスパッタによる1-2nm程度の白金コーティングでも観察可能であったが、長時間の観察では次第に切片表面に割れが生じることが分かった。導電性が不十分なため、反射電子像の観察で問題になるほどの帯電は生じないが、試料の熱ダメージを防ぐことができていないと思われる。導電性を向上させるため、導電性物質をコーティングしたITOコートスライドガラスの利用を試みたが、切片が破れた部分ではITO由来の反射電子が非常に強く、樹脂切片の観察には適しないことが分かった。
上記と並行して、従来の蛍光顕微鏡法で広葉樹材の放射柔細胞における非セルロース性多糖類および糖タンパク質の免疫局在を網羅的に観察した。その結果、ヘミセルロース標識の分布は木部繊維と共通しているが、ペクチンおよび糖タンパク質標識の分布は木部繊維と異なっていることが明らかとなり、ペクチンおよび糖タンパク質は放射柔細胞の機能と何か関係があると考察した。

Strategy for Future Research Activity

当初計画では、スライドガラス4枚を96穴マクロプレートシステムで使用するためのアダプタを作製する予定であったが、96穴プレートでは液漏れが発生し、免疫標識に使用することができなかった。そのため、マルチチャンネルピペットや自動洗浄機に対応した、スライドガラス3枚を装着できる穴数を減じたプレートへの改良を試みている。また、マルチチャンネルピペットの間隔の穴を有する撥水性シートを印刷したスライドガラスを特注し、スライドガラス単体でも多数の切片を免疫標識する方法を試みる。
樹脂包埋切片のFESEM観察では、切片の破れが問題になることが分かったため、2019年度の試料採取の際は、従来の透過型電子顕微鏡試料調製の際にも増して樹脂の浸透を向上させる。さらなる導電性の向上を目的として、オスミウムプラズマコーターの利用も検討する。
放射柔細胞における非セルロース性多糖類および糖タンパク質の免疫標識の結果、蛍光顕微鏡での蛍光標識の局在と電子顕微鏡での金コロイド標識の局在が異なる場合があった。これは蛍光標識二次抗体と金コロイド標識二次抗体のサイズの違いに起因する可能性がある。金標識二次抗体のサイズを極力蛍光標識二次抗体のサイズに近づけるため、ナノゴールド（1.4nmの金粒子）標識二次抗体の利用を検討する。

Causes of Carryover

当初計画で予定していたマイクロプレートシステムの作製が遅延しており、十分な回数免疫標識実験を行うことができなかった。またそれに伴い、使用予定であった抗体試薬の購入およびスライドガラス用FESEM試料ホルダの特注作製を見合わせたため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額は、マイクロプレートシステムの改良経費、抗体試薬の購入、スライドガラス用FESEM試料ホルダの特注作製費用に充てる。