湖沼で神経毒を生産するラン藻類のモニタリングと制御に向けたゲノム基盤研究

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05785
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 程木 義邦 京都大学, 生態学研究センター, 特定准教授 (60632122)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 朴 虎東 信州大学, 学術研究院理学系, 教授 (20262686)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: シアノバクテリア / シアノトキシン / 神経毒 / モニタリング / 比較ゲノム

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、湖沼で経毒アナトキシン-aを生産するシアノバクテリアCuspidothrix issatschenkoiの発生制御手法を確立することを最終的な目的とし、単離培養株を用い、神経毒合成遺伝子群の遺伝的変異と毒生産能の関係の評価、全ゲノム・遺伝子発現解析を行い、遺伝子レベルで本種有毒株の生態学的特性について評価を行う。
初年度は代表的な有毒株であるC. issatschenkoi RM-6のコンプリートゲノムを決定した。本年度は、引き続きC. issatschenkoi単離株のゲノム解析を行った。本研究グループが全国の湖沼から単離した有毒株と無毒株、計21株について大量培養を行い解析に用いた。これらの株はC. issatschenkoi以外にも従属栄養細菌が含まれているため、平成30年度に確立したリゾチームと界面活性剤を用いた従属栄養細菌の除去方法で処理し、遠心で藻体を回収、DNAを抽出しゲノム解析用に用いた。これら21培養株についてショートリード解析とともに、一部の株についてはナノポアによるロングリード解析も行い、両データを用いてゲノムアッセンブリを試みた。しかし、昨年度にコンプリートゲノムが得られた株よりも従属栄養細菌の混入量が多く、多くの株について十分なカバレッジが得られなかった。そのため、来年度も引き続き本解析を継続して行う。また、琵琶湖から単離された有毒株を用い、本種の培養環境や成長段階と神経毒アナトキシンaの生産量の関係を調べた。その結果、毒生産量が最大となる温度や強光環境下で栄養細胞が破壊し、アナトキシンaが細胞外に排出されることが確認され、本種有毒株の現存量の季節変化と共に、アナトキシンaの生産および細胞外排出の季節パターンも明らかとなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

比較ゲノム解析を行うため、平成30年度に引き続きCuspidothrix issatschenkoi単離株のゲノム解析を複数の株で行った。しかし、従属栄養細菌の混入量が予想よりも多かったため、ほとんどの株について十分なカバレッジが得られなかった。そのため、来年度も引き続き本解析を継続して行う必要があるが、研究開始当初の予想よりも多くの株のゲノム情報が得られるため、研究の進捗としては成果を得るのが予定よりもやや遅くなるものの、十分なデータが得られることが期待できる。
また、単離株を用いた培養実験により、本種有毒株の環境特性や神経毒アナトキシンaの生産や環境中への排出に関わる要因について詳細なデータが得られ、次年度に行う自然湖沼のモニタリングでも、注目する環境要因を選定する上でとても重要な知見となった。

Strategy for Future Research Activity

最終年度となる令和２年度は、引き続きCuspidothrix issatschenkoi単離株のゲノム解析を行うとともに、当初の計画通り実際の湖沼で本種有毒株とアナトキシンaのモニタリングを行う。これまでに本種有毒株が検出されている２～３の湖沼を対象とし、月１～２回程度の頻度でサンプリングを行う。これまでの研究により、神経毒アナトキシンaの生産能は株ごとに大きく異なる。そのため、本種有毒株と無毒株、アナトキシンaの季節変化と共に、出現する株（遺伝子型）毎の組成を評価する。そのため、並行して研究を進めるゲノム解析の結果よりアナトキシンa合成遺伝子上に生じている変異を明らかとし、これらの変異部を標的としたマーカーの開発を行い定量に用いる。