2019 Fiscal Year Research-status Report
Inactivation of Norovirus in midgut gland of oyster using anti Norovirus IgY
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18K05789
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
勢戸 祥介 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70270759)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ノロウイルス / 養殖牡蠣 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度に確立した牡蠣へウイルス等を取り込ませる条件で以下の実験を行い中腸腺内で抗原抗体反応が起こっていること確認した。すなわち、購入した試験用マガキを小型水槽(人工海水、水温20℃)に投入し約6時間回復させた後、呼吸や排泄が確認できた個体を試験に供した。試験水槽(25L)に牡蠣6~8個ずつ分配した後、FCV 107TCDI50/mLウイルス液25mLを加え水槽全体が均一になる よう軽く混ぜたのち18時間蓄養してウイルスを取り込ませた、その後新しい人工海水に全換水し、試験群の水槽には抗FCV IgY（10mg/mL）、対照群の水槽には正常産卵鶏由来Control IgY（10mg/mL）を400mL添加し22時間蓄養しIg Yを取り込ませた。蓄養後、開殻し中腸腺を摘出した。中腸腺１個を滅菌3mmステンレスビーズおよび２mLの注射用滅菌水を含む5mLチューブに移し、細胞破砕機(Micro Smash、トミー精工，MS- 100)で4,500 rpm、15秒間の破砕を2回実施した。中腸腺破砕液の遠心上清(10,000 x g, 10分)を0.45μmの 滅菌フィルターでろ過後、ウイルス量を測定した。ウイルス量はCRFK細胞(ネコ腎細胞)を用いた50%培養細胞感染価TCID50)（培養法）およびTaqMan probeを用いたリアルタイムPCR法によるネコカリシウイルス遺伝子コピー数の測定を行なった。対照群では培養法およびリアルタイムPCR法で中腸腺当たり100～1、000個のウイルスが検出された。試験群ではリアルタイムPCR法で100～100/中腸腺検出されたが培養法では検出限界以下であった。このことから、中腸腺内に取り込まれたFCVに添加した抗FCV IgYが結合し不活化したものと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ノロウイルス代替FCVを取り込ませた牡蠣を抗FCV IgY 添加海水中で蓄養することにより、中腸腺内に蓄積したFCVを不活化することができた。
ノロウイルスVLPと抗ノロウイルス IgYあるいはControl IgYと混合し室温で３０分間抗原抗体反応をさせた後、ノロウイルスVLPと抗ノロウイルス IgYの混合液からはノロウイルス抗原が検出できなくなることを確認した。
ノロウイルスVLPを取り込ませた牡蠣を抗ノロウイルス IgYあるいは Control IgY添加海水中で蓄養した後中腸腺を摘出し、中腸腺破砕液を市販のノロウイルス検出キット（クイックナビノロ２、デンカ生研）を用いてノロウイルス抗原の検出を行った。Control IgY添加群ではノロウイルス抗原を検出することができたが、抗ノロウイルス IgY添加群では検出できなかった。このことから中腸腺内ノロウイルスVLPにおいても抗ノロウイルス IgYで不活化することが可能であると考えられた。
しかしながら、中腸腺内のウイルスに対してIg Yが直接作用しているかどうかの確認が出来ていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
中腸腺内に蓄積したウイルスにIg Yが直接作用し不活化していることの確認のため、中腸腺内で抗原抗体（ウイルス+Ig Y）反応を直接的に証明できる蛍光抗体法あるいは免疫沈降法等の方法を確立する。さらに、実際の牡蠣浄化水槽を用いた試験に協力していただける牡蠣養殖業者の策定を行う。
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| Causes of Carryover |
2019年10月に開催された第７回国際カリシウイルス会議（オーストラリア）への参加を計画していたが、日程が合わず参加を見送ったため、旅費に余剰金が発生した。余剰金については2020年度物品費として実験用プラスチック器具等消耗品購入に充てる予定である。
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Research Products
(1 results)
