2019 Fiscal Year Research-status Report
ヘテロカプサ赤潮はなぜ貝類のみをへい死させるか―不安定毒素の全容解明への挑戦－
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18K05809
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| Research Institution | Fisheries Research and Education Agency |
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Principal Investigator |
山崎 康裕 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産大学校, 講師 (40598471)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
紫加田 知幸 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 瀬戸内海区水産研究所, 主任研究員 (40603048)
内山 郁夫 基礎生物学研究所, ゲノム情報研究室, 助教 (90243089)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 赤潮 / ヘテロカプサ / 溶血活性 / トランスクリプトーム / 二枚貝へい死 / シオミズツボワムシ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
渦鞭毛藻Heterocapsa circularisquama（以降，ヘテロカプサ）は，貝類に極めて強い毒性を発現する赤潮の原因種である。先行研究により，ヘテロカプサの毒素は膜タンパク質であると推定されたが，速やかに失活するため毒素の精製が困難である。そこで本研究では，毒性の異なるヘテロカプサ細胞の各種遺伝子発現量を比較して毒性発現に関わる遺伝子群を見出すとともに，毒素候補の一次配列から作製したポリクローナル抗体を用いた免疫学的研究による貝類へい死機構の解明を目的とした。
昨年度は，ヘテロカプサ強毒株と弱毒株（各1株）のトランスクリプトーム解析を実施し，ヘテロカプサ強毒株が有する溶血活性に関連する可能性のある複数の遺伝子群を見出した。また，シオミズツボワムシ（以下，ワムシ）を用いたバイオアッセイの結果，増殖段階や培養条件による毒性の変化を観察した。そこで本年度は，複数の強毒株および弱毒株を対象としてRNA-seq解析を実施して毒素候補遺伝子の探索を試みるとともに，アサリを用いた毒性判定試験および間接蛍光抗体法によるヘテロカプサ細胞における毒素の局在部位について検討した。
トランスクリプトーム解析では，傾向が類似する昨年度に解析した2株と本年度に解析した3株における強毒・弱毒の組み合わせ（計3通り）について比較した結果，全てのケースで有意(PDR<0.05)に強毒＞弱毒（139個）もしくは弱毒＞強毒（49個）となる遺伝子を見出した。また，ワムシに強い致死効果を示すヘテロカプサ強毒株は試験開始から48時間後にアサリの生残率を30％程度まで低下させたのに対し，弱毒株曝露区における試験開始から48時間後のアサリ生残率は100％であった。さらに，毒素候補の一次配列から作製したポリクローナル抗体による間接蛍光抗体法を実施した結果，ヘテロカプサの細胞表面にシグナルが検出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度の研究では，本年度に得られたトランスクリプトーム解析結果（強毒1株と弱毒2株）に昨年度の結果（強毒1株と弱毒1株）を加えてクラスタリングや多次元尺度構成法により解析した結果，両解析のクラスターはヘテロカプサの毒性や分離海域によって分類されなかったため，この原因は更なる解析が必要である。このため，傾向が類似する昨年度に解析した2株と本年度に解析した3株における強毒・弱毒の組み合わせ（計3通り）について比較し，強毒株で共通して発現量に有意差(PDR<0.05)のある遺伝子を探した。結果として，強毒＞弱毒で139個，弱毒＞強毒で49個の遺伝子が見出された。今後，これらの遺伝子の機能などをさらに追究していく予定である。
一方，ヘテロカプサのトランスクリプトームデータ（毒素候補タンパク質の一次構造）からエピトープを人工合成・免疫し，得られたポリクロ―ナル抗体を用いた間接蛍光抗体法による標的タンパク質の蛍光観察に成功した。また，このポリクローナル抗体で処理したヘテロカプサ強毒株は，未処理区に比べてワムシに対する毒性が低下した。ただし，本毒素候補タンパク質がヘテロカプサの毒素本体であるか否かを確定するためには，ポリクローナル抗体の交差反応の有無やポリクローナル抗体処理がヘテロカプサの遊泳力に与える影響等について更なる詳細な検証が必要である。以上のことから，当該年度はヘテロカプサの毒素本体や毒性発現メカニズムの解明に繋がる基礎的知見が集積できたことから，研究はおおむね当初の計画通りに遂行できたと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は，さらに毒性発現に関与する遺伝子や毒性発現メカニズムの解明を進めるために，強毒株の増殖段階や栄養塩欠乏下における毒性変化に着目してトランスクリプトーム解析を実施する予定である。また，得られた解析結果に基づき，ヘテロカプサの毒素産生に関与する代謝経路や二枚貝に対する毒性発現メカニズムの解明を進める予定である。
一方，毒素候補タンパク質の一次構造からエピトープを人工合成・免疫して抗体を作製し，ヘテロカプサ細胞における毒素の局在部位や毒素の毒性発現メカニズムについて検証を進める予定である。解決すべき課題として，ポリクローナル抗体の交差反応の有無やポリクローナル抗体処理がヘテロカプサの遊泳力に与える影響等に関する詳細な検証が挙げられる。よって，最終年度は毒性の異なる複数のヘテロカプサ株や他種植物プランクトンを用いて免疫学的研究を実施することにより，ポリクローナル抗体の交差反応の有無を精査する予定である。また，細胞の形状や遊泳速度等について解析を実施することにより，ポリクローナル抗体処理がヘテロカプサの遊泳力に与える影響について検証する予定である。最後に，現場で発生したヘテロカプサ，もしくは毒性の異なるヘテロカプサ株を用いて確立したバイオアッセイ手法や免疫学的手法による毒性評価を試みる予定である。
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| Causes of Carryover |
理由：次世代シーケンス解析およびポリクローナル抗体作製等に係る費用が当初の見積額より安価となったことから，当該助成金が生じた。
使用計画：生じた助成金は，翌年度分として請求した助成金と合わせ，次世代シーケンス解析費用や脂質解析費用として利用する予定である。
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