2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒラメの有眼側特異的色素胞分化および無眼側の分化抑制を制御するメカニズムの解析
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18K05813
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
横井 勇人 東北大学, 農学研究科, 助教 (40569729)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 徹 東北大学, 農学研究科, 教授 (70344330) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒラメ / 左右非対称 / 色素胞 / 白化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒラメやカレイ類は変態を経て左右非対称な体色を呈するが、人工飼育下では無眼側の黒化や有眼側の白化などの体色異常が発生して問題となっている。本研究では、変態後の成体型色素胞の左右非対称な分化について、有眼側特異的な色素胞分化とともに、無眼側における色素胞の分化抑制に着目し、その分子メカニズムを明らかにするために研究を行っている。ブラジル産アルテミア（BA）給餌により生じる白化をモデルとし、有眼側で異所的に色素胞分化が抑制されるメカニズムを次世代シーケンサーによる遺伝子発現プロファイルの比較により解析する。実験群のBA給餌群と対照群の米国ユタ産アルテミア（UT）給餌群について、HiSeq2000によるRNA-seq解析により発現強度の異なる遺伝子を同定した。まずRT-PCRにより、ドライデータを検証した。続いて、遺伝子の機能を発生遺伝学的に解析するために、ゼブラフィッシュをモデルとして実験を進めている。ゼブラフィッシュオーソログを単離し、RT-PCRとwhole mount in situ hybridizationにより発現様式を解析したが、これまでのところ、発生過程における顕著な発現は観察されなかった。CRISPRゲノム編集による機能解析を進める予定であるが、COVID-19の影響で実験は中断している。再開後にすぐにインジェクションを始めるように、候補遺伝子の再評価とgRNAのデザイン、ノックイン方法について検討している。色素胞分化に関与する新規遺伝子については、先行して実験を進めている２遺伝子について、GFPノックイン系統を作成し、F0の中から遺伝子発現を再現したGFP蛍光を示す個体を選別し、さらにF1以下、系統として安定して維持できる状態にすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゼブラフィッシュをモデルとした色素胞の分化抑制に関する実験は、COVID-19の影響もあって実験が中断しているが、一方で先行して進めていた色素胞分化関連遺伝子のノックイン実験については、F1を採取して系統化の目処がついており、今度実験再開後には速やかに掛け合わせして、ホモ個体における表現型を解析する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
色素胞分化への関与が考えられている新規遺伝子について、CRISPRを用いたGFPノックイン系統の作成に成功している。これらは現在ヘテロで系統化を進めてつつ、GFPレポーターの発現をトレースして色素胞分化との関連を解析しているが、今後はホモ個体で機能喪失個体の表現型を解析する。またこれら遺伝子の発現開始時期の違いとマーカー遺伝子との比較を通して、色素胞分化への寄与について詳細を明らかにする。
また、有眼側における色素胞分化抑制に関与する遺伝子については、実験再開後にCRISPRを用いてGFPノックイン系統を作成するために、候補遺伝子の再評価とgRNAのデザイン、ノックイン方法について準備を進める。
現在は実験ができる状態ではないが、最低限、系統化したノックイン個体と野生型実験系統の維持に努める。
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| Causes of Carryover |
2019年中は、ほぼ計画通りに予算執行した。COVID-19の影響により、3月に計画されていた国際学会と国内学会の開催が中止され、また一部の実験計画について変更し、関連した試薬・物品を次年度に購入することとした。
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