2018 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集とターゲットシークエンスによる特定ゲノム領域内の責任遺伝子単離の高速化
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18K05816
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
中本 正俊 東京海洋大学, 学術研究院, 博士研究員 (80447721)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂本 崇 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (40313390)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アユ / 水産育種 / ゲノム編集 / 性分化 / 性決定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では水産重要種であるアユの性決定遺伝子をモデルとして、ゲノム編集技術とターゲットシークエンス法を駆使して、遺伝学的に同定された目的形質と連鎖するゲノム領域内に位置する多数の候補遺伝子の中から責任遺伝子を効率的にスクリーニングするための水産育種技術基盤を開発することを目的とする。アユはXX-XY型の性決定様式でありY染色体上の性決定遺伝子によって性が決まると考えられている。これまでの遺伝学的解析によりY染色体上の性決定領域は約1Mbpまで限局化されており、この領域内には多数の候補遺伝子が位置していた。平成30年度はまず性決定ゲノム領域に位置するいくつかの候補遺伝子についてcDNAのクローニングを行いエクソン／イントロン構造を明らかにした。また精巣および卵巣からRNAを抽出し、RT-PCR法により候補遺伝子mRNAの発現を解析した。次に予備実験としてアユにおけるcrispr/cas 法によるゲノム編集の条件検討を行った。クローニングした性決定遺伝子候補cDNAのエクソン内にガイドRNAを設計し、Cas9とともにアユ受精卵へのマイクロインジェクションを行った。人工受精のあとマイクロインジェクションを行うまでの時間、受精卵の保持方法、インジェクション針の形状等を検討し、マイクロインジェクション条件の最適化を試みた。現在、作出したゲノム編集アユを飼育し、孵化率、孵化後の生残率、発生への影響等の評価を行っている。また、ヒレの一部からDNAを抽出し、ゲノム編集により標的領域に変異が導入されているか、編集効率はどのくらいかについて解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通り進捗した。平成30年度はY染色体上の性決定ゲノム領域に位置する候補遺伝子のクローニングとゲノム編集アユの作出条件の検討を行った。いくつかの候補遺伝子はY染色体上の性決定ゲノム領域に位置し、生殖腺で発現しており、候補遺伝子の絞り込みは順調に進んでいると言える。またアユ卵に対するマイクロインジェクションの基礎技術を確立した。今年度、本格的にアユ性決定遺伝子候補の網羅的なノックアウト実験を行うことで本研究の目的が達成できることが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きこれまでに同定したY染色体上の性決定ゲノム領域に位置する候補遺伝子のクローニングを行い、既知の遺伝子との相同性や生殖腺での発現パターンから候補遺伝子の絞り込みを行う。絞り込んだアユ性決定遺伝子候補について、計画通りcrispr/cas法による網羅的なノックアウトを行う。一度に10から30個程度の遺伝子に対するガイドRNAとCas9 mRNAを混合してアユ卵にマイクロインジェクションにより導入し、確率論的にノックアウトすることを試みる。同時にノックアウトする候補遺伝子の組み合わせを変えたゲノム編集アユを複数ロット作出し、候補遺伝子のうちいくつかがランダムにゲノム編集された可能性のあるアユ集団を作出する。ゲノム編集アユはロットごとの識別は行わず混合して、鰭および生殖腺の外部形態から雌雄を判別できるサイズまで飼育する。次に遺伝的性と表現型が一致しない個体、すなわちゲノム編集により性転換が起こっている個体を探索する。生き残ったすべてのゲノム編集魚の鰭と生殖腺を固定する。鰭からDNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いたターゲットシークエンスにより変異導入部位の塩基配列を決定する。ゲノム編集魚における候補遺伝子内の変異の有無と目的形質の表現型の相関関係を集団全体として解析し責任遺伝子の同定をする。すなわち目的形質に影響がみられなかった個体ではゲノム編集による変異がなく、影響が観察された個体においてのみ変異が導入されていた遺伝子が責任遺伝子であると考えられる。
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