2020 Fiscal Year Research-status Report
light-dependent hemolytic agents isolated from red tide phytoplankton
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18K05823
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
小田 達也 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 客員研究員 (60145307)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 赤潮 / 微細藻類 / シャットネラ / カレニア / ヘテロカプサ / ポルフィリン誘導体 / 溶血毒素 / 活性酸素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
魚類に強い致死作用を示す赤潮原因微細藻類であるラフィド藻類シャットネラは高レベルの活性酸素を常に産生する特性を有することがこれまでの我々の研究で明らかにされている。シャットネラの他、日本で甚大な赤潮被害を引き起こす有害赤潮原因微細藻類として、渦鞭毛藻類ヘテロカプサ及びカレニアが知られている。これらの赤潮微細藻類の毒性機構の詳細は未だ不明であるが、様々な角度からの毒性機構解明の取り組みにより、これら微細藻類はいずれも溶血毒素を有していると推定されている。また、いずれも超音波処理などの物理的細胞破壊により細胞外に光依存性溶血因子を遊離する。ヘテロカプサの先行研究により、細胞からのアルコール抽出液に光依存性溶血因子としてポルフィリン誘導体が含まれていることを見出している。さらにシャットネラ及びカレニアにもヘテロカプサと同様な光依存性溶血因子がアルコール抽出液に存在することを見出した。ヘテロカプサ由来ポルフィリン誘導体の生物活性の多面的解析から、本物質はヘテロカプサ自身やシャットネラ及びカレニアに対しても致死作用を示すことを見出した。さらに、細菌、特にグラム陽性菌であるブドウ球菌に強い抗菌作用を示し、その作用には光で誘導される活性酸素の一種である一重項酸素が関与している知見を得ている。ヘテロカプサ由来ポルフィリン誘導体はヒトがん細胞株HeLa細胞に対しても光依存的細胞毒性を示す結果が得られた。その細胞毒性は細胞膜破壊を伴うネクロシス誘導によると推定されている。ヘテロカプサ由来ポルフィリン誘導体は構造が異なる複数の類似誘導体が存在する事、さらにシャットネラ及びカレニアにもポルフィリン骨格を主体とする複数の活性物質が存在すると推定されており、それらの構造解析及び生物活性の詳細解析にはさらに多面的研究が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
魚類の鰓組織及び血中の活性酸素消去酵素であるスーパーオキシドデスムターゼ及びカタラーゼ活性の魚類間での比較検討を実施し、これらの酵素活性がシャットネラ毒性に対する魚類の感受性を左右する要因である可能性が示唆された。一方、本年度はコロナウイルスパンデミック問題、施設での停電や雨漏り等の発生により微細藻類培養装置に多々トラブルが発生し、当初の計画が妨げられたが、何とかこれまで継続培養維持してきた微細藻類株の消失は避けることができた。微細藻類は一般に動物細胞株のような凍結保存法が確立されていないことから、株の維持には継代培養が必須である。このような状況下において、シャットネラ、ヘテロカプサ及びカレニアのアルコール抽出液には常に一定レベルの光依存性溶血活性が検出され、これらの活性物質は長期に人工的培養条件下で継続培養しても安定的に細胞内で生産される物質であることが明らかとなった。従って、培養状態が一時的に悪化しても、微細藻類が有する光依存性溶血因子の生産性は消失する事は無く、培養維持の回復が達成できれば継続的研究遂行は可能であると判断出来た。微細藻類の培養状態の回復期間中、新たな試みとして天然大型藻類からの殺藻物質の探索にも取り組んだ。その結果、九州沿岸に自生する紅藻類から、大変興味ある脂肪酸誘導体が見出された。本物質はシャットネラ、ヘテロカプサ及びカレニアに強い細胞毒性を示すのみならず、グラム陽性細菌やがん細胞に対しても毒性を示すことがわかった。海洋性藻類は興味ある生理活性物質探索の素材としての重要性が再認識できた。今後、シャットネラ、ヘテロカプサ及びカレニアに存在する光依存性溶血因子、加えて紅藻類の脂肪酸誘導体の生理活性について構造活性相関との観点から研究することにより、多くの興味ある知見が得られると期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヘテロカプサの光依存的溶血因子は複数の構造が異なる類似誘導体が存在することが明らかにされている。最も多く存在するポルフィリン誘導体の構造と生理活性に関して先行して研究を進め、多くの知見を得るに至っているが、その他の比較的少量存在する類似誘導体に関しては未だ未解析である。シャットネラ及びカレニアにもヘテロカプサと同様な光依存的溶血因子が存在する事は確認されているが、その構造や活性の詳細解明にはさらに研究が必要である。カレニアのアルコール抽出液をSephadex HL20によるクロマトグラフィーに供したところ、ヘテロカプサと同様、大小２つのピークが検出され、光依存的溶血活性は２番目の小さいピークに集中して検出されることが見出された。吸収スペクトルから、このピークにポルフィリン誘導体が含まれていると判断出来た。従って、この画分をTLC及びHPLCに供し、高純度に精製後、構造解析へと進めていく予定である。構造解析には多くの精製物が必要であることから、これまで以上の大量培養により、原料となるカレニア細胞を調整する。これまでの培養技術経験から、し尿瓶の形状がカレニアの高濃度細胞培養に適していることから、し尿瓶培養法を実施する。構造解析はこれまでのヘテロカプサ研究で確立した方法を採用する。生理活性解析は赤潮微細藻類に加え、細菌類及び癌細胞に対する細胞毒性を中心に進める。抗菌作用に関しては引き続きグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対する作用を比較すると共に、メチシリン耐性菌など抗生物質多剤耐性菌に対する有効性を追求する。癌細胞に対してはアポトーシス誘導能の有無及びその機構を解析する。本年度見出した紅藻由来脂肪酸誘導体ではカスパーゼの活性化、DNA断片化、アネキシン陽性細胞の上昇などの作用が見出されていることから、ポルフィリン誘導体についても同様な技術で細胞毒性機構の解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
コロナウイルスパンデミック問題、施設での停電や雨漏り等の発生により微細藻類培養装置に多々トラブルが発生し、当初の計画に比べ微細藻類の培養が妨げられ、構造解析や細胞レベルでの生理活性解析が遅れたため、物品費の使用が計画より下回った。本年度参加を予定していた国際学会、国内学会がコロナウイルスパンデミック問題で参加できず、旅費の執行が無かった。
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