海洋プランクトン幼生の成長：摂餌の消化・吸収と栄養素の伝播・受容

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05829
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 金子 洋之 慶應義塾大学, 文学部(日吉), 教授 (20169577)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 倉石 立 慶應義塾大学, 文学部(日吉), 准教授 (60195526) ; 古川 亮平 慶應義塾大学, 文学部(日吉), 助教 (90458951)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 海洋プランクトン / 棘皮動物 / ヒトデ幼生 / 摂餌 / 成長 / 凝縮 / サイズ / 神経回路

Outline of Annual Research Achievements

棘皮動物イトマキヒトデの発生過程において、母性栄養に依存して形態形成を進行させる胚期と比べ、自身で摂餌して成長する幼生期にはどのような形態的特性が認められるかという視点から解析した。開口直後の時期から、珪藻（Chaetoceros calcitrans）をビピンナリア幼生（BP幼生）に給餌し、非給餌個体と比較しつつ、個体サイズと１個体当たりの細胞数を測定した。給餌１～２日では、非給餌個体より給餌個体の体長は有意に短かった。一方、細胞数は給餌個体の方が明らかに多かった。この事実は、摂餌を開始した初期には、BP幼生は身体を凝縮させていることを示唆する。
Bp幼生初期の形態形成を観察したところ、非給餌個体とくらべ、給餌個体では、（１）体腔嚢の融合が完了すること、（２）繊毛帯は肥厚し、この領域で単位長あたりの細胞数が多いこと、（３）繊毛帯領域での神経細胞の配置は緩やかに進行すること、（４）一部の神経細胞は、間充織細胞に特異的なメタロプロテアーゼを発現していることが観察された。以降、給餌下でのBP幼生は神経回路を梯子状に構築しつつ、身体のサイズを増加させ変態可能なブラキオラリア幼生（Br幼生）に成長した。一方、非給餌下のBP幼生は、神経回路を発達させることが出来ずに、Br幼生に到ることはなかった。
給餌下に成長する異なった時期のBP幼生、ならびに成長に必須な餌の消化吸収の要となる胃細胞において、それらに発現する遺伝子パターンの解析用のサンプル調整を始めた。種々の発生段階のBp幼生（２日、５日、８日、１２日）からRNA抽出の準備を整えた。一方、1,8-ANSで処理した５日幼生をグリシン処理し、解離された蛍光発色性の胃細胞をセルソータにアプライした。予想通りの細胞数割合で機械のチャネルを通過していることは認められたが、チャネル分離後に細胞破損が生じRNA抽出ができない状況である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

給餌による身体のサイズ増加や形態的な神経細胞の状態解析は、凝縮作用の発見など興味深い現象も見出しており、順調に推移していると評価できる。本データを公表し、研究推進に向けて有意義な議論を行う目的で、日本動物学会89回大会の口頭発表にエントリーしていたが、北海道肝振東部地震の発生により、当目的は達せられていない。
本研究課題の一つの柱である、「セルソータを用いた胃細胞の分画、ならびにその発現遺伝子情報の解析」のアプローチが暗礁に乗り上げている。1,8-ANSで前処理した５日幼生は、蛍光顕微鏡下において紫外光で胃領域のみが発色する。受精後5日目のビピンナリア幼生に1,8-ANS処理を施し、グリシン溶液を用いて個々の細胞にまで解離して、申請者らが所属する慶應大学共同解析室に配備されているセルソータにアプライした。海水に浮遊する生きたままの解離細胞に対して、セルソータは稼働し、予想する割合で蛍光標識された胃細胞がセルソータ内の細いノズルを通過していることは確認された。ここまでは期待どおりの結果であるが、最終的に胃細胞を分離回収した際に、視認できるはずの量の胃細胞を取得できなかった。これは、ノズル通過後の分離過程で、細胞を包括していた海水が、一挙に生理食塩水と混ざり合い、海産生動物の細胞の背景となる液の浸透圧が減少し、目的の胃細胞は膨潤して構造が脆弱になり、遠心操作で破砕され、発現遺伝子の採取に必要なRNAが上清中に四散してしまった推測される。今後、胃細胞を健常な状態で集めることに関して、ハードルを乗り越える必要が認められる。

Strategy for Future Research Activity

摂餌による成長における神経細胞の関与については、神経細胞に特異的に発現する遺伝子に着目して、その遺伝子の単離を進め、部分配列は取得できている。今後、遺伝子単離を完遂し、全長の配列情報を取得した後、モルフォリノオリゴをデザインして、神経細胞の機能阻害を解析する。全長の塩基情報が取得できない場合には、部分情報からモルフォリノオリゴをデザインせざるを得ないが、当遺伝子の抗体を持っているため、原因と結果に整合性を得る実験を成立させ得ると考えられる。単離完遂までの推移にかかる時間をみながらではあるが、より完璧な状態で実験を遂行していく。
一方、1,8-ANS処理により標識された胃細胞の分離に関して、回収に時間が掛からない、より迅速な方法として、胃細胞の割合を50％近くまであげて、多くの割合の胃細胞を短時間に集めるアプローチを考えている（原腸単離法）。一方、現在の実験状況でも胃細胞を分画することはできているので、セルソータを稼働させる際に生理食塩水でなく海水の使用が可能な環境を探すことも考えている。両アプローチとも成功しない場合には、次善の策として原腸単離法で胃細胞の割合が50%程度にまで上がったサンプルからRNA分取を行う。また、蛍光物質の注入による栄養成分の拡散に関しては、今年度から着手する。

Causes of Carryover

ビピンナリア幼生から胃細胞分離に用いているセルソータでは、低張の生理食塩水を使用せざるを得ないことが研究の遅れにつながっている。このため、予定していた胃細胞のRNA抽出が出来ずに、遺伝子情報の網羅的取得用に予定していたRNA-seq外注費用を支出しておらず、比較的に多額の費用が未使用となっている。また、ビピンナリア幼生の身体に蛍光物質を顕微注射し、拡散パターンを追跡する実験に関しては、分担者が別の資金で解析システム用のPCを購入したため、予定していた経費の使用を見合わせた。
セルソータによる胃細胞の分画後に予定している遺伝子発現の網羅的解析において、大量の遺伝子情報の読み取りが必要である。これに関し、自身の研究室で大量に遺伝子情報を取得可能なシステム構築が別途に進んでいるプロジェクトのもと整い始めている状況である。RNA-seq法を外注で遂行することを予定していたが、自前で任意の回数、短期間でRNA-seq法を行い、試行錯誤の余裕を持ちながら発現遺伝子データを収集することが可能になってきている。自身の研究室の解析技術の改良に鑑み、2018年度に予定していた研究費の積み残し分（RNA-seq外注費、PC購入費）を、シークエンス関連の消耗品費へ転用することを計画している。