2018 Fiscal Year Research-status Report
Visualization of teleost ammonia excretion mechanisms by using super-resolution microscopy
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18K05832
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
廣井 準也 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 准教授 (20350598)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 超解像イメージング / 塩類細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は，優れた酸性耐性を示すウグイを中心的な実験魚種として用い，アンモニアの排泄・H+の排出・Na+の取り込みをつかさどるトランスポーター群について調べた．
従来より，ウグイの鰓の塩類細胞においてNa+/H+交換体（NHE3）とNa+/HCO3-共輸送体（NBC1）が共局在するという酸性順応モデルが提唱され多くの研究者に受け入れられてきたが，本研究において，まずnhe3とnbc1のmRNAレベルを定量PCRによって測定したところ，酸性環境においてnhe3の発現量は増加したがnbc1の発現量に変化はみられなかった．つぎに，抗ウグイNHE3抗体と抗ウグイNBC1抗体をもちいて同時多重免疫蛍光染色をおこなったところ，ウグイの塩類細胞はNHE3陽性細胞とNBC1陽性細胞の2種に明確に区別され，NHE3とNBC1は決して同一の塩類細胞に共局在しないことが明らかとなった．ウグイのNHE3陽性細胞とNBC1陽性細胞はそれぞれ，ティラピアのIII型およびII型塩類細胞と似た特徴を呈した．また，酸性環境において，ウグイの塩類細胞は集合して頂端部を共有し濾胞状構造をとることが明らかにされていたが，濾胞状構造の構成細胞の大多数はNHE3陽性細胞であること，さらに，個々のNHE3陽性細胞の頂端膜が大きく陥入して外部環境と不完全に隔離されたmicro environmentを形成していることが明らかとなった．
上記のNHE3とNBC1の蛍光イメージングにおいて，共焦点レーザー顕微鏡とデコンボリューションソフトウェア（SVI Huygens Essential）を組み合わせた超解像イメージングを行なった．蛍光プローブとして新型のAlexa Fluor Plus二次抗体を採用したところ，従来のAlexa Fluor二次抗体よりもシグナル対ノイズ比が高く，良好な超解像イメージングが可能となった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
優れた酸性耐性を示すウグイについて超解像イメージングを行うことにより，酸性耐性の低いニジマスやタイセイヨウサケでは観察されることのなかったNHE3陽性細胞の頂端膜のinfoldingを発見することができた．このinfoldingによって形成される外部環境と不完全に隔離されたmicro environmentは，アンモニアの排泄・H+の排出・Na+の取り込みが共役しているというRh-NHEメタボロンモデルの存在を裏付ける大きな証拠となりうる．
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| Strategy for Future Research Activity |
ウグイについては，抗ウグイNHE3抗体と抗ウグイNBC1抗体が使用可能だが，現在のところ，アンモニア排出機構のかなめとなるRhcg1をタンパクレベルで検出することができない．よって次年度はウグイRhcg1の特異抗体の作成を目指す．NHE3陽性細胞に局在すると予測されるRhcg1に加えて，Rhcg2とRhbgに対する抗体も作成する．研究代表者の所属大学の共通機器室にZeiss LSM800 with Airyscanが導入される予定であり，デコンボリューションソフトウェア（SVI Huygens Essential）を組み合わせることによって高度な超解像イメージングが可能となる．
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| Causes of Carryover |
抗ウグイRhcg1，Rhcg2，Rhbg抗体について，ユーロフィンジェノミクス社のペプチド合成・抗体作製サービスを予定していたが，複雑な抗原デザインのため，今年度中の発注が不可能となった．次年度の出来るだけ早い時期に発注を計画している．
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