2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of the techniques for production of genome editing gametes with in vitro genome editing of germ line stem cells and surrogate broodstock technology
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18K05836
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| Research Institution | Fisheries Research and Education Agency |
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Principal Investigator |
吉川 廣幸 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産大学校, 助教 (40733936)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | トラフグ / 代理親魚 / ゲノム編集 / トランスフェクション / 生殖幹細胞 / クサフグ / 借り腹 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集は、簡便に優良形質品種を作出できるスピード育種の切り札として期待されている。しかし、現行の魚類受精卵への顕微注入によって編集ツールを導入された変異導入初代を始祖として比較的大型の海産養殖品種を作り出すには、交配による有用遺伝子変異の固定が必須となるが、その成熟誘導には長期の養成期間と大規模飼育スペースが必要不可欠であり、これらがスピード育種実現の妨げとなっている。本研究では、生殖幹細胞へのゲノム編集ツール導入技術を開発し、これら編集ツール導入細胞を直ちに代理親とする小型近縁種へと移植することによる代理親体内での短期間かつ小飼育スペースなゲノム編集配偶子生産法の確立を目指す。本年度は、生殖幹細胞へ導入するゲノム編集ツールの①設計および②導入方法および導入条件の検討を行った。
①ゲノムデータベースの配列情報に基づき、黒色色素の発現に関与するslc45a2遺伝子をターゲットとして、CRISPR/Cas9システムによりトラフグゲノム中のslc45a2遺伝子を破壊可能なガイドRNA （crRNAおよびtracrRNAから構成）の設計を行った。作成したガイドRNAとCas9タンパク質を顕微注入によりトラフグ受精卵へ導入したところ、顕微注入胚での色素形成不全および変異導入が確認できた。
②トラフグ精巣を酵素分散により調整した精巣細胞に対し、①のゲノム編集ツールを市販のリポフェクションkitまたはエレクトロポレターにより導入可能か検討した。なお導入の成否については、蛍光色素を付与したtracrRNAを用いることにより、導入処理後の蛍光の有無によりその成否を判定した。その結果、市販のリポフェクションkitでは蛍光を有する細胞は観察されなかったものの、エレクトロポレターを用いた導入法により蛍光を伴った細胞が出現することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究を通し、黒色色素形成関連遺伝子を、CRISPR/Cas9システムにより破壊可能なゲノム編集ツールの設計を完了できた。また、エレクトロポレーションによりこれらゲノム編集ツールを精巣細胞内へ導入可能なことを見出せた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに明らかにしたエレクトロポレーションによる導入手法を用いてドナーとするトラフグの生殖細胞へゲノム編集ツールを導入し、これらの細胞を宿主とするクサフグへ移植する。そして、移植されたドナー細胞の宿主生殖腺内への生着や増殖能について評価していく。また、現在までに検討してきたゲノム編集ツール導入方法以外の導入条件についても引き続き検討を続ける。
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| Causes of Carryover |
当初、エレクトロポレーターの購入を予定していたものの、機器デモを通して最適と判断された機種が予算金額よりも高額であったため、機器購入を断念した。このため他機関所有の機器を借りることにより本研究を進めることとなり、それに伴う出張費用、消耗品費用や補助員の賃金等に充てていく予定である。
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Research Products
(1 results)
