2019 Fiscal Year Research-status Report

PIF4タンパク質制御による二酸化窒素センシング機構の解明

Research Project

Project/Area Number	18K05926
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	高橋美佐広島大学, 統合生命科学研究科(理), 助教 (10294513)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	二酸化窒素 / シロイヌナズナ / PIF4 / 胚軸伸張 / 環境応答
Outline of Annual Research Achievements	大気中に含まれる二酸化窒素（10~50 ppb）はバイオマス蓄積の促進、栄養生長および花芽形成促進を正に制御する植物成長調節因子であることを明らかにした。二酸化窒素のかかる調節機構の究明は、植物生物学の基礎や新規学術領域の創成、また二酸化窒素は自然にどこにでもあるものであるが故に環境無負荷、省エネルギーしかも高収量の画期的農業生産技術開拓の視点からも重要である。植物がどのように二酸化窒素を受容するか(センシング機構)は、同調節分子機構の解明における必須不可欠の課題である。胚軸長を指標として胚軸伸長の二酸化窒素感受性欠失変異株をT-DNA挿入ラインから選抜、解析し、同二酸化窒素不感受性株の原因遺伝子がPIF4であることを明らかにした。本研究はその分子的実態を究明し、PIF4タンパク質制御による二酸化窒素センシング機構の解明をめざした。昨年度までの研究から、二酸化窒素はPIF4タンパク質量に影響しないこと、二酸化窒素によりPIF4の制御下にある遺伝子のプロモーター領域へのPIF4タンパク質の結合が減少することを示した。本年度はPIF4タンパク質の翻訳後修飾であるニトロ化についてウェスタンブロット解析を行なった。二酸化窒素存在下で栽培したPIF4pro::PIF4-HA/pif4植物からタンパ質を抽出、抗HAタグ抗体を用いてアフィニティー精製したPIF4タンパク質をSDS PAGEで分離、抗ニトロチロシン抗体を用いウェスタンブロット解析した。その結果、PIF4タンパク質のニトロ化シグナルは検出されなかった。 PIF4タンパク質は複合体を形成してプロモーター領域に結合することが知られている。酵母ツーハイブリッド法、BiC法を用いた相互作用解析を行うために、ベクターの構築、酵母およびシロイヌナズナの形質転換体を作出した。現在、酵母ツーハイブリッド法を用いて解析中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初予定をしていた解析に関しては、概ね終了することができ、一定の結果を得た。
Strategy for Future Research Activity	今後は、研究計画に従って、タンパク質の翻訳後修飾の解析に焦点を絞って研究を遂行する。Hisタグ融合PIF4組換えタンパク質を発現させた大腸菌からNiカラムを用いてPIF4-Hisタグタンパク質をアフィニティー精製、抗ニトロチロシン抗体を用いてウェスタンブロット解析を行い、PIF4タンパク質の二酸化窒素によるニトロ化の有無を明らかにする。活性窒素による翻訳後修飾としてニトロソ化が知られている。従って、ニトロソ化についても解析する。