2018 Fiscal Year Research-status Report
リグニン変換スマート細菌の創製につなぐ細胞内レドックス動態の解明
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18K05932
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| Research Institution | Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology |
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Principal Investigator |
大田 ゆかり 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 海洋生命理工学研究開発センター, グループリーダー代理 (40399572)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | リグニン / 補酵素 / 酸化還元酵素 / トランスクリプトーム / レドックスバランス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、リグニン関連低分子に対する代謝の終点が異なる2株のスフィンゴモナド細菌を被検対象とし、これらの菌株がリグニン関連物質を代謝する際の酸化還元酵素反応に関わる補酵素量の変化、細胞内レドックスバランス調節機構、ならびにこれらの要素が代謝表現形に及ぼす影響についての基盤的知見を得ることを目的としている。
H30年度は、被検株2株のゲノム解析を行い、遺伝子領域の決定やアノテーションを行った。KEGGやKAASデータベースを利用して、遺伝子セットから代謝のポテンシャルを推定した。
また、対象株のゲノム上の遺伝子改変を目的として、形質転換技術の確立に向けて、予備的検討を行った。予備検討では、被検株の糖やアミノ酸の資化性試験、抗生物質耐性試験を行った。さらに、大腸菌をドナーとして、広域プラスミドの接合伝達が可能であることを確認した。ドナーとして使用する大腸菌株と被検株の抗生物質耐性濃度が接近していること、被検株の増殖速度が大腸菌のそれより遅いことにより、形質転換実験において偽陽性となるコロニーが多く検出された。
また、今後、被検株の代謝変化を検出するため、液体クロマトグラフィー質量分析（LCMS）、ガスクロマトグラフィー質量分析（GCMS）を用いて、アミノ酸ならびにNAD(H)、グルタチオン（酸化型・還元型）などの補酵素類を分析する条件の検討を行った。検討の段階で、補酵素の酸化還元状態が容易に変化することが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
被検細菌2株のコンプリートゲノム情報を取得し、今後のトランスクリプトーム解析に向けての準備を進めることができた。また、被検株の形質転換や代謝物の分析開始に向けての予備検討も進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
被検株の形質転換効率を向上するとともに、偽陽性を排除するため、菌株の増殖に必要な栄養源や塩類について、詳細な条件検討を進める予定である。
今後、検菌株の代謝物の変化を追跡する際には、補酵素の細胞内における酸化還元状態を精確に反映した定量を行う必要がある。対象とする補酵素は容易に酸化されやすいため、精度の高い定量分析を行えるよう、抽出・前処理・分析の格段階において、手法の見直しや最適化を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
納入業者間の相見積等を通じ、物品の納品価格を抑えることができたため、次年度使用額が生じた。H31年度には標準品等の試薬の購入に使用する。
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