2019 Fiscal Year Research-status Report
リグニン変換スマート細菌の創製につなぐ細胞内レドックス動態の解明
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18K05932
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
大田 ゆかり 群馬大学, 食健康科学教育研究センター, 講師 (40399572)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | リグニン / 補酵素 / 酸化還元酵素 / トランスクリプトーム / レドックスバランス / 接合伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年までに得た被験株のゲノム情報を基に、本年度は1株についてトランスクリプトームデータを解析し、リグニンモデルダイマーと抽出リグニンの両方によって強く発現が誘導される遺伝子群を見出した。検出された一連の遺伝子には、これまで着目していなかった酸化還元酵素2種が含まれていた。そこで、本遺伝子から組換え酵素を作成しその活性を確認した。その結果、着目した遺伝子がリグニンモデルダイマーのCalpha位の酸化活性を示すことが判明した。この反応はバクテリアが行うリグニン主要結合の特異的開裂に必要な複数のステップの第一段階目を担う反応に相当する。これらの酵素群は先行研究での解析例が限られていることから、本知見は環境微生物や環境DNA配列情報から同酵素活性を検出する際の指標にも活用できる重要な情報である。
また昨年度に引き続き、対象株のゲノム上遺伝子の改変を目的として大腸菌を供与菌とする接合法を用いた形質転換条件確立のために、供与菌栄養要求性と広域ベクター上のカナマイシン耐性遺伝子を形質転換時の二重選抜に利用する方法に着手した。形質転換を加速するため、当初は菌増殖が良好な高栄養合成培地を用いる方針としたが、受容菌宿主薬剤耐性が非常に高くなり、擬陽性が頻出するなど形質転換体の選別に困難が生じた。そこで天然培地と多様な抗菌剤の使用を再検討した結果、合成抗菌剤であるナリジクス酸による供与菌抑制が全体を通しての形質転換効率や速度の向上と形質転換体後の選抜に有効であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画に従い、ゲノム情報の獲得、遺伝子発現差異解析による未同定遺伝子の機能確認、ゲノム上の遺伝子破壊実験へと進めることができた。これらの過程で新知見が得られ、さらに次年度の遺伝子破壊実験のための好適な条件を見出すことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度までに得られた知見に基づき、リグニン代謝への関与が示唆される被験菌ゲノム上の遺伝子について、接合と相同組換えによる破壊を行う。野生株と破壊株を用いて、リグニンモデル化合物や抽出リグニンに対する代謝の変化を追跡する。
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| Causes of Carryover |
細胞内代謝物の解析に液体クロマトグラフィー質量分析装置（LCMS）の使用を予定した。本年度4月に代表者が研究機関を異動したため当該装置の移管を行ったが、これに長時間を要したことから、本装置を用いた解析数が予定より少なかった。次年度はLCMS分析数を増加させる予定であり、必要な試薬・消耗品類に使用する。
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[Presentation] Fractionation and analysis of lignin-carbohydrate complex using lignin-degrading enzymes2019
Author(s)
Saho Kashima, Hiroshi Nishimura, Shizuka Sakon, Misato Yamada, Yasuhiro Shimane, Yukari Ohta, Keiko Kondo, Yudai Yamaoki, Takashi Nagata, Masato Katahira, Takashi Watanabe
Organizer
1st International Lignin Symposium
Int'l Joint Research
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