2019 Fiscal Year Research-status Report
胚が着床能力を獲得する制御機構の解析と移植する胚の質的評価法の樹立
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18K05936
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
松本 浩道 宇都宮大学, 農学部, 教授 (70241552)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福井 えみ子 宇都宮大学, 農学部, 教授 (20208341)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 繁殖 / 生殖 / 着床 / 受胎 / 妊娠 / 胚培養 / 体外受精 / 胚盤胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
体外受精胚の移植では、受胎率および産子率が低い。これまでの多くの研究にもかかわらず改善されていない。このことは従来の研究に加え、新規のアプローチが必要であることを示している。これまで着床と妊娠の成立に関する研究に取組み、マウス胚の着床能力獲得過程に関するタンパク質の発現や分解の制御機構について新たな知見を報告してきた。また、それらの分子機構を指標として、胚盤胞における遺伝子とタンパク質の発現を培養系で賦活化し、母体由来のシグナルに対する応答能力を高めた状態にして子宮へ胚移植するというアプローチで、マウス体外受精由来胚盤胞の着床能力を改善する手法を構築した。
着床率が改善されたということは、通常の培養系では着床しない胚における着床能力に正の効果があった結果である。一方、胚盤胞が着床能力を獲得する分子機構を明らかにするためには、胚の着床能力において負に作用する因子も同定し、それらを組合せて解析することが有効である。
これまでの研究で、アミノ酸の組合せがマウス胚の着床率を正と負に制御することが示唆されていた。そこで、アルギニン（Arg）とロイシン（Leu）がマウス胚の着床能力関連因子の発現に及ぼす影響を解析した。
マウス胚用の培養液にArgまたはLeuを添加し、胚盤胞を培養後に胚移植を行ったところ、Argは着床率を低下させたのに対し、Leuは着床率に影響しなかった。一方で、ArgとLeuの複合処理は着床率を上昇させた。Argは一酸化窒素（NO）の材料となるので、NO合成酵素（NOS）の関与が考えられる。そこでマウス胚におけるNOSアイソフォームの発現動態を解析したところ、ArgはeNOSの発現を上昇させていた。また胚盤胞におけるNO産生を非侵襲的なライブアッセイ法で解析することを目的として、NO産生速度と測定時間の条件検討を行い、胚盤胞における至適測定条件を確立させた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究成果は、着床関連因子を三つの因子群に分類する必要性を示唆していた。すなわち、着床に必要な因子である因子A群、着床に必要な因子で着床時に局在の変化する因子である因子B群、着床能力誘起時に発現するが着床期には消失しなければならない因子である因子C群、である。また、それらの分子機構を指標として、胚盤胞における遺伝子とタンパク質の発現を培養系で賦活化し、母体由来のシグナルに対する応答能力を高めた状態にして子宮へ胚移植するというアプローチで、マウス体外受精由来胚盤胞の着床能力を改善する手法を構築してきた。
着床率が改善されたということは、通常の培養系では着床しない胚における着床能力に正の効果があった結果である。一方、胚盤胞が着床能力を獲得する分子機構を明らかにするためには、胚の着床能力において負に作用する因子も同定し、それらを組合せて解析することが有効である。これまでの研究で、アミノ酸の組合せがマウス胚の着床率を正と負に制御することが示唆されていた。そこで、ArgとLeuがマウス胚の着床能力関連因子の発現に及ぼす影響を解析した。その結果、Argは着床率を低下させたのに対し、Leuは着床率に影響しなかった。一方で、ArgとLeuの複合処理は着床率を上昇させた。すなわち、正に作用するアミノ酸および負に作用するアミノ酸の組合せをそれぞれ同定することができた。
ArgはNOの材料となるので、マウス胚盤胞におけるNOSアイソフォームの発現動態を解析したところ、ArgはeNOSの発現を上昇させることが明らかになった。胚盤胞におけるNO産生を非侵襲的なライブアッセイ法で解析する至適測定条件を確立させるため、NO産生速度と測定時間の条件検討を行った。さらにNO産生におけるアミノ酸の作用を検討したところ、Argは過剰なNO産生を促進させ、胚盤胞の着床能力に関与していることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
・胚盤胞の酸素消費におよぼすアミノ酸の作用
NO産生におけるアミノ酸の作用を検討したところ、Argは過剰なNO産生を促進させ、胚盤胞の着床能力に関与していることが示唆された。単離したミトコンドリアにおいてNOはシトクロムcオキシダーゼのO2消費を抑制することが報告されている。よってArg処理区ではNO産生の増加により、O2消費が抑制されたことで、着床率が低下した可能性が考えられる。そこで本研究では、細胞内酸素消費のライブアッセイを行う。まず、測定蛍光試薬の添加濃度、添加時間、反応開始からの酸素消費速度と測定時間などの条件検討を行い、胚盤胞における至適測定条件を確立させる。次に、各種アミノ酸の添加培養時における酸素消費を測定する。また同一胚においてNO産生と酸素消費を同時に測定する検出系を作出し、アミノ酸の作用がNO産生と酸素消費の相互作用にどのように影響するかを明らかにする。
・胚盤胞のミトコンドリア機能におよぼすアミノ酸の作用
酸素消費にはミトコンドリア機能が関与している、そこで、MitoTrackerでミトコンドリア膜電位を検出することにより、ミトコンドリア機能のライブアッセイを行う。まず、測定蛍光試薬の添加濃度、添加時間、反応開始からのミトコンドリア膜電位変化と測定時間などの条件検討を行い、胚盤胞における至適測定条件を確立させる。次に、各種アミノ酸の添加培養時におけるミトコンドリア膜電位を測定する。また同一胚において酸素消費とミトコンドリア膜電位を同時に測定する検出系を作出し、アミノ酸の作用が酸素消費とミトコンドリア膜電位の相互作用にどのように影響するかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
タンパク質の発現解析を含め、いくつかの実験項目が予定よりはかどらなかった。以上の理由から、次年度使用金額が生じた。
これについては、実験を円滑に進める為の物品費として使用する。また、研究成果を学会等で発表するための旅費としても使用する。
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