2019 Fiscal Year Research-status Report
Generation interspecies germ cell and reproductive organ in the mice by nobel experimental system
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18K05938
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
山城 秀昭 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (60612710)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉村 智史 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (00728454)
笹岡 俊邦 新潟大学, 脳研究所, 教授 (50222005)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | GATA4 / ゲノム編集 / 生殖巣 / キメラマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GATA4は性腺の分化に関与する遺伝子の転写を制御する転写因子で、精巣・卵巣の発達における重要な役割を担っていると考えられている。一方、胚発生および心筋の分化と機能に関与する遺伝子も調節するため、欠失が起こると、胎生致死となりGATA4ホモ欠損マウスを作出することは極めて困難である。本年度では、GATA4ホモ欠損マウスの作製を目的に、ジーンターゲッティング法を用いて標的とする遺伝子領域をCreリコンビナーゼ標的配列loxPで挟んだ遺伝子座を持つGATA4-floxマウスの作製を試みた。C57/BL6ゲノムライブラリーよりBACクローンを単離、DNAを抽出し、Red/ET組み換え法によるBACサブクローニング法と多重遺伝子導入法を用いてターゲッティングベクターを作製した。エレクトロポレーション法によりES細胞へターゲッティングベクターを導入し、薬剤耐性ES細胞を選抜した。サザンブロット解析により樹立した組換えES細胞をICRマウス8細胞期胚に注入し、受精卵移植を施した。その結果、3匹の雄キメラマウスを得て、ES細胞寄与率は、それぞれ約50％、70％、100％であった。自然交配によりキメラマウスとBL6雌マウスを交配し、生殖系列キメラマウスを同定することにより、F1ヘテロマウスの作製に成功した。現在、Vasa-Cre TGマウスとの交配を実施しており、得られたマウス生殖巣のフェノタイプについて解析する計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
C57/BL6マウス由来ゲノムライブラリーよりBACクローン（RP23-247I8）を単離し、マウスゲノムDNAを抽出し、これを基にRed/ET組み換え法によるBACサブクローニング法とMultisite Gateway を用いた多重遺伝子導入法（LR reaction）を組み合わせ、ターゲッティングベクターを作製した。エレクトロポレーション法によりES細胞へターゲッティングベクターを導入し、G418薬剤耐性ES細胞を選抜した。組換えES細胞の同定にはサザンブリットハイブリダイゼーション法で行った。3’側のloxP配列の存在確認はPCR法で解析した。同定された組換えES細胞をICRマウス8細胞期胚に注入し、偽妊娠マウスの子宮に移植した。その結果、GATA4-floxターゲッティングベクターを作製し、ES細胞へエレクトロポレーション法により導入した。その後、サザンブロットハイブリダイゼーション法により２クローンを同定した。8細胞期胚にES細胞を注入した後に受精卵移植（ET）を行い、3匹のキメラマウスを獲得することができた。さらに、平行して進めているウシES細胞の樹立の実験を行い、ES細胞様コロニーを作製した。
そのため、現在までの進捗状況は、おおむね順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
GATA4-floxコロニーのホモコロニー拡大を行い、それらをVasa-Creと交配させ産子のフェノタイプを確認する。生殖巣欠損であることが望まれる。サンプルは採取時の写真と組織標本を採る。その後、これらの胚をストックし、胚盤胞補完法にてマウス・ラットES（蛍光発色）細胞インジェクションを行い、キメラ動物の生殖巣を確認する。マウスESキメラはその後、交配し産子を取る。ラットESキメラは♀キメラは過剰排卵後IVF、♂キメラは顕微授精を行い産子獲得を目指す。
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| Causes of Carryover |
最終年度の令和2年度に実験を加速させるため、最低限の物品費に抑制したため。
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