長期維持型卵胞の形成増強法の開発と卵巣機能への影響の解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05944
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 杉本 実紀 京都大学, 農学研究科, 助教 (20243074)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 哺乳類 / 卵巣 / 卵胞 / 雌 / 生殖 / 生殖寿命

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、哺乳動物の卵巣で性成熟後まで休眠・維持され生殖寿命後期の卵子産生に寄与する長期維持型卵胞の形成を増強することにより雌の生殖寿命の延長は可能か、また、未成熟期から発育を開始する早期発育型の卵胞は必要かを明らかにすることである。本年度は、前年度に引き続きマウスにおいて長期維持型顆粒層前駆細胞として報告されている胎仔/新生仔期卵巣中のLgr5発現細胞について、機能解析および特異的発現遺伝子の検索のために十分な品質および量を得るため、卵巣の分散処理と抗体結合ビーズを用いた細胞分離における純度・収率の改善のための検討を行った。当初、遺伝子発現検索の材料を集める目的で前年度の検討結果に基づき細胞の分離回収を行ない免疫染色により陽性細胞を確認したが、回収される細胞が少数であるとともに反応が弱く、陰性分画の細胞と比較して明瞭な差異があるとは言えなかった。そのため、以前に使用した抗体および新規の抗体1種も加えて検討したが十分な結果が得られなかった。また一部の条件について、Lgr5 mRNA発現量を測定したところ、標本数が少なく確定できないが、陽性分画、陰性分画ともに同時期の胎仔卵巣より低く、分画間では同程度であった。これは細胞分離過程での細胞の損失による可能性があり、今後検討する。またLgr5のアゴニストであるR-spondin 1のマウス新生仔への投与を以前の実験と条件を変えて行い（以前の検討で予備検討のみ実施）、卵胞数を計測したが、今回調べた生後7日時点では処理区間で卵胞数および発育段階に差異は見られなかった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

細胞分離の結果が不十分だった事により、予定していた遺伝子発現解析の材料を揃えることができなかった。

Strategy for Future Research Activity

細胞分離の条件の再検討と遺伝子発現解析の材料採取および解析実施を優先する。細胞の分画に不具合がある原因としては物理的な損失（サイズでの分画、器具への吸着）も考えられるが、細胞死の可能性もあるので細胞分離の過程での保護剤の使用を検討する。また、細胞分散の過程の表面抗原の損傷に対する対策として、回復培養を加えることを検討する。陽性分画細胞の陰性分画への混入については、分画法の変更で改善できない場合、より早い発生段階の卵巣の体細胞を陰性分画細胞の代替として使用することを検討する。また、機能性因子の添加培養および動物への投与による検討も並行して行う。

Causes of Carryover

遺伝子発現の解析を外部委託する予定であったが、材料が揃わず、間に合わなかった。次年度、材料の準備ができ次第、解析を発注する。その他、試薬、器具類、実験動物の購入および共通機器使用料に使用する