長期維持型卵胞の形成増強法の開発と卵巣機能への影響の解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05944
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 杉本 実紀 京都大学, 農学研究科, 助教 (20243074)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 卵巣 / 哺乳類 / 卵胞 / 雌 / 生殖寿命

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、哺乳動物の卵巣で、性成熟後まで休眠・維持され、生殖寿命後期の卵子産生に寄与する長期維持型卵胞の形成を増強することにより雌の生殖寿命の延長は可能か、また、未成熟期から発育を開始する早期発育型の卵胞は必要かを明らかにすることである。本年度は長期維持型顆粒層前駆細胞の分離・回収について、前年度までの実験で結果不良であったLgr5発現による選択に代わり、局在に基づく分離・回収法を検討した。出生前後のマウス胎仔/新生仔期卵巣の表層にこれらの細胞が存在するという報告に基づき、出生直前にあたる日齢の胎仔の卵巣で検討を行った。以前の検討で酵素処理時間の調節による分離ができなかったことと、細胞の種類によらず表層の細胞を採取する目的では特定の抗原に対する抗体の使用などは適さないと考えたことから、卵巣表面をビオチン化して分離する計画を立てた。当初、抗ビオチン抗体を使用した方法を試みたが細胞の損失が顕著であったため手法を変更し、ストレプトアビジン標識磁気ビーズとの結合による細胞の分画・回収を行った。表層細胞の蛍光色素標識後に回収を行って検討した結果から分画が十分ではない可能性は高いが、ビーズ結合画分および非結合画分として回収された細胞について、RNAシーケンス法による発現遺伝子の比較を行った。技術的トラブルや解析委託先の違いにより少し条件が異なるが、複数回の細胞採取・解析で共通して細胞群間で発現変動が見られる遺伝子を抽出した。長期維持型原始卵胞の形成を促進する機能性因子の検索については、マウス胎仔卵巣の器官培養系でLgr5のアゴニストであるR-spondin 1とこれがシグナル伝達を増強するWnt3aの共添加の効果を検討したが、今回の処理条件では顕著な効果はないようであった（解析継続中）。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

細胞の分画・回収と発現遺伝子の解析の初期段階までは行えたが、長期維持型卵胞の形成への関与の可能性の検討や、長期維持型顆粒層前駆細胞の分離・回収に有用な遺伝子の同定はまだできていない。

Strategy for Future Research Activity

細胞画分間で発現に差異が見られる遺伝子について、得られたデータを再解析・再検討し、差異の明確さ、発現量などに基づいて細胞マーカーとしての利用や機能解析において有用であると考えられる遺伝子を選択し、in situ hybridization法や免疫染色により卵巣での局在と日齢による変化を調べる。局在および時間的動態が妥当な遺伝子については、可能であれば機能解析を行う。また、機能性因子の検索については培養条件で検討を要する点があるので、変更した条件での解析を追加する。

Causes of Carryover

遺伝子発現解析に関連した費用が想定したより低く抑えられた。また、解析結果を得るまでに時間を要し、その後の検討が未実施になった。試薬、器具類、実験動物の購入および共通機器使用料に使用するとともに、遺伝子発現解析の追加が必要であれば外部委託により行う。