2018 Fiscal Year Research-status Report
イヌの新規ゲノムワイドDNAメチル化解析：腫瘍性疾患特異的DNAメチル化の同定
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18K05964
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
山崎 淳平 北海道大学, 獣医学研究院, 助教 (20732902)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
市居 修 北海道大学, 獣医学研究院, 准教授 (60547769)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | エピゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イヌの悪性黒色腫におけるエピジェネティクス特にDNAメチル化に関し、次世代シークエンサーを用いて新たな知見を得ることによってイヌの悪性黒色腫のメカニズムを解明することにつなげるため、平成30年度は以下の項目について検討を行った。
DREAM（Digital Restriction Enzyme Analysis of Methylation）法によるゲノムワイドなDNAメチル化の変化の検出
申請者らが樹立したイヌ悪性黒色腫腫細胞株4株よりDNAを抽出、制限酵素処理を行った後、アダプター結合からPCRを行うことによって、次世代シークエンサーに最適な目的のサイズを持ったライブラリを作製した。次世代シークエンサーによる解析を行ったところ、全ての検体において約125,000～180,000箇所のCpGサイトのDNAメチル化の定量的な解析が可能であった。実際にこれらの配列を用いて解析をおこなったところ、DNAメチル化状態の類似性によって分類した結果、悪性黒色腫細胞株群と正常組織群の区別が可能であり、また、悪性黒色腫細胞株間においても異なるDNAメチル化状態が存在することが示された。さらに、各々の悪性黒色腫細胞株において3,000～5,000箇所の高メチル化部位が発見された。これらのうち、特に高メチル化部位の近傍には腫瘍に関連すると考えられる遺伝子が認められた。現在この結果に関して、論文投稿中である。
さらに、イヌの悪性黒色腫自然発症例16例についても同様の解析・検討を行ったところ、症例によって異なるゲノムワイドなDNAメチル化の変化が検出され、これを用いてグループ分けすることによって、臨床的なパラメータと独立した予後因子の同定を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1.これまでのイヌ、ならびに獣医領域におけるDNAメチル化の研究はヒトの研究などから類推した限られた遺伝子のプロモーター領域に焦点を当てたものであるが、本研究ではゲノムワイドなDNAメチル化解析が可能であるDREAM法を用いて実際にそのダイナミックな変化を検出した。特に、各々の悪性黒色腫細胞株において3,000～5,000箇所の高メチル化部位が発見された。これらのうち、特に高メチル化部位の近傍には腫瘍に関連すると考えられる遺伝子が認められた。また、現在悪性黒色腫自然発症例16例とさらに追加16症例の計32症例のDNAメチル化ゲノムワイド解析を行っている。
2．一方で、検出されたDNAメチル化の変化による機能的な悪性黒色腫発生や、悪性度の関連などとの証明までには至っていない。候補遺伝子の適切な抽出、遺伝子発現解析、In vitroにおける機能解析等が必要であり、今後臨床検体を含めたさらなる解析を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果によって、イヌの悪性黒色腫においてもダイナミックかつゲノムワイドなDNAメチル化の変化が認められた。今後、細胞株、正常細胞そして実際の臨床検体を用いた多角的な視点から解析を行うことによって、悪性黒色腫のメカニズムまた症例の予後に関連する因子の探索を行う。また、同様の手法を肝細胞癌および移行上皮癌においても、その詳細なメカニズムの解明や多数の症例に応用可能なDNAメチル化を用いた確固たる予後因子の樹立などを念頭におき研究を推進していく。
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Research Products
(1 results)
