2019 Fiscal Year Research-status Report

オリゴデンドロサイト前駆細胞を用いたTmem86aの機能解析

Research Project

Project/Area Number	18K06000
Research Institution	Osaka Prefecture University
Principal Investigator	小森雅之大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (40183347)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	プラスマローゲン / Tmem86a / リゾプラスマロゲナーゼ / オリゴデンドロサイト前駆細胞
Outline of Annual Research Achievements	令和元年度は未だオリゴデンドロサイト前駆細胞の培養系の確立には至っておらず、引き続き培養条件等の検討を行っている。市販のラット組織由来cDNA（8種類）を用いたRT-PCR法によりTmem86aの発現を調べたところ、心臓が最も高く、次いで脾臓が高く、脳や肝臓では低かった。一方、Tmem86b（リゾプラスマロゲナーゼ）は肝臓が最も高く、次いで精巣が高く、脳、腎臓、骨格筋では低かった。ヒトTmem86aの異種発現に関してはFLAGタグ付き全長タンパク質の発現には成功しなかったが、C末端側半分をTmem86bのN末端側半分と融合させたキメラタンパク質をメタノール資化酵母で過剰発現させることができた。現在、さらに種々のキメラタンパク質の異種発現について検討している。一方、酵母での過剰発現に成功したFLAGタグ付加ヒトTmem86bについては発現酵母ミクロゾームから可溶化・精製した標品を用いてリポソーム再構成系でのリゾプラスマロゲナーゼ活性の検出を試みたが検出できなかった。さらに、ヒトTmem86bとGFPとの融合タンパク質の酵母での発現にも成功し、小胞体マーカー（BiPのN末30残基とmCherryとの融合タンパク質）との共発現株を用いて融合タンパク質が小胞体に局在することを明らかにした。最後に、ヒトTmem86aに対する特異抗体を作製するために、組換え体大腸菌より調製したマルトース結合タンパク質との融合タンパク質のうち、C末端側81残基との融合タンパク質を精製し、マルトース結合タンパク質部分をプロテアーゼで消化した後、Tmem86a由来ペプチドの回収を試みたが、不溶化などのため抗原として充分な量は得られなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ヒトTmem86aの異種発現が非常に困難であったが、異種発現に成功したヒトTmem86bと融合させたキメラタンパク質の発現を検討したところ、ようやくC末端側半分をTmem86bのN末端側半分と融合させたキメラタンパク質の発現に成功した。しかしながら、代表者の病気治療（約1ヶ月間の入院治療後、現在も通院治療中）や新型コロナ感染症のため、研究は遅れ気味で現在も実質的に停滞している。
Strategy for Future Research Activity	ヒトTmem86aのC末端側半分をTmem86bのN末端側半分と融合させたキメラタンパク質の過剰発現に成功したので、さらにTMEM86a部分を増やしたキメラタンパク質の発現を検討したい。また、最近、N末端領域に特定のアミノ酸残基を導入することにより発現効率が上昇することや膜タンパク質の疎水性アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換して（QYTコード）水溶性化できることが報告されたので、Tmem86aについても検討してみたい。さらに、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養系が確立したらsiRNAによるノックダウンやゲノム編集によるノックアウトを行いTmem86aの機能を検討したい。
Causes of Carryover	代表者が昨年の11月より難病と言われる病気を発症し、年末年始を含む約1ヶ月間入院治療していたため、予定していた物品費や旅費などを執行できなかった。これら未使用分については翌年度に繰り越し、次年度に使用する予定である。なお、現在も通院治療を継続しているが、順調に回復しており日常生活（研究遂行）には支障がない。しかしながら、新型コロナ感染症のため、研究は現在、実質的に停滞している。