2019 Fiscal Year Research-status Report
新規抗血栓薬の開発に向けた猫の先天性血液凝固第XII因子欠乏症の病態解明
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18K06004
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
丸山 治彦 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (60434106)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ネコ / 第XII因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血栓治療では抗凝固薬が使用されるが、現行の薬剤は副作用として出血傾向を生じることが問題となっており、そのような副作用を有さない薬剤の開発が切望されている。第XII因子（Factor XII：FXII）は血液凝固因子の1つであるが、その欠乏症では観血的処置などでも異常出血を全く呈さないことが知られている。近年、医学領域ではFXIIが血栓形成や炎症を調整していることが明らかとなり、FXIIを阻害することで出血傾向を生じにくい新規抗凝固薬のターゲットとして注目されている。先天性FXII欠乏症は猫では比較的よく遭遇する疾患である。そこで、猫や犬において高い抗凝固作用を有しつつ出血傾向を生じにくい新規抗血栓薬の開発を目的とし、猫の先天性FXII因子欠乏症の病態解析として遺伝子解析を実施した。さらに先天性FXII欠乏症の迅速かつ簡便な遺伝子診断の確立を試みた。
前年度の研究で明らかとなった新規遺伝子変異3つの遺伝子組換タンパクの作出を試みた結果、プラスミドDNAベクターの作製が困難を極めたが、2種類の変異のベクターが完成しつつある。これまではネコF12遺伝子の全エクソン領域をシークエンスするために5個の領域に分断してPCRにて遺伝子を増幅していたが、遺伝子診断確立のための手技簡便化に向け全エクソンを1回のPCR法で増幅するプライマーセットの作出を試みた。しかし、良好な結果を得られるプライマー配列やPCR条件が定まらず、さらなる検討が必要である。さらにこれまでの我々の研究結果から国内で最も発生が多いことが推察されたp.G544A変異の迅速診断のために、リアルタイムPCRを用いたCycleave PCR法の確立を試みたが、高い正確性を有する結果は得られておらず、プローブ再設計など更なる検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
プラスミドDNAベクターの作製において、変異を作出するためのPCRで遺伝子の良好な増幅が得られないために大腸菌への形質転換や得られたDNAプラスミドベクターのシークエンスを繰り返し試みることになった。しかしながら、3種類の遺伝子変異のうち、2種のプラスミドベクターについては概ね作製が完了しつつあり、シークエンスにて正しい塩基配列が得られているか確認するのみである。
従来、ネコF12遺伝子の全エクソン領域をシークエンスするために5個の領域に分断してPCR法を実施していたが手技が煩雑であることから、簡便化のために全エクソンを1回のPCRでF12遺伝子全長を増幅するプライマーセットの作出を試みた。しかしながら、良好な結果を得られるプライマー配列やPCR条件が得られておらず、さらなる検討が必要である。
昨年度までの我々の研究結果でp.G544A変異が国内で最も発生が多いこと示唆された。その変異の保有状況を調査し血栓症との関連性を明らかにする上で遺伝子変異検出の迅速手技の確立は必須であることから、従来のシークエンス法に変わり、リアルタイムPCRを用いたCycleave PCR法の確立を試みた。しかし、高い正確性と再現性を有する結果は得られておらず、プローブ再設計など更なる検討が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究計画に変更はなく、引き続きこれまで実施している研究を継続して行っていく。プラスミドベクターの作製が完了し次第、哺乳動物細胞へ遺伝子導入し組換えタンパクを発現させ、ウエスタンブロット法にてその発現パターン、そして血液凝固時間測定によるFXII活性の解析を行う。F12全長PCRでは、プライマーの再設計に加え、新たな種類のPCR酵素を用いて検討を重ねていく。CycleavePCRでは、非特異増幅を生じない新たなプローブおよびプライマーセットの設計とPCR条件を模索する。これらは、前年度同様に並行して進めていく。
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| Causes of Carryover |
FXII遺伝子変異の組換えタンパク発現用ベクターの作出、そしてネコF12遺伝子変異のPCR法による検出法の改良を試みたが、順調な確立には至らなかった。そのため、細胞培養試薬やPCR試薬の購入量が当初の予定を下回った。しかし、ベクター作製は概ね完了したことから、令和2年度は細胞培養を開始し遺伝子組換えタンパク発現を実施する予定であり、それに関連する消耗品を購入する計画である。また、F12遺伝子変異解析のPCRにおいてもプライマーやPCR酵素の変更などにより早期解決に向け実験を進め、それに要する消耗品の購入を行う予定である。
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