Elucidation of pathophysiology of congenital factor XII deficiency in cat for the development of novel antithrombotic therapy

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K06004
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 丸山 治彦 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (60434106)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ネコ / 第XII因子

Outline of Annual Research Achievements

第XII因子（Factor XII：FXII）は血液凝固因子の1つであり、先天性FXII欠乏症は猫では比較的よく遭遇する疾患である。猫の先天性FXII因子欠乏症の病態解析として、これまでに見いだされた遺伝子変異のFXII蛋白の発現様式への影響を検討した。さらに先天性FXII欠乏症の迅速かつ簡便な遺伝子診断法の確立を試みた。
これまでの研究で明らかとなった新規遺伝子変異の3種類のうち、1種類の一塩基置換変異の遺伝子組換タンパク発現を実施したが、ウエスタンブロット解析（肉眼）では野生型と変異型との発現に差異を見出すことができなかったため、デジタルCCDでの解析を進めている。残り2つの変異については発現プラスミドの構築を試みているが成功には至っていない。
ネコF12遺伝子の全エクソン領域の遺伝子シークエンスをするために、現在は5個の領域に分割してPCRにて遺伝子を増幅しており手技が煩雑となっている。そこで手技の簡便化に向け全14個のエクソンを含むネコF12遺伝子全長を1回のPCR法で増幅するプライマーセットを設計し、種々の条件でのロングPCRを試みた結果、約8kbの単一バンドとしての増幅に成功した。しかし、その増幅産物のシークエンスでは一部の領域において反応不良のために塩基配列を決定するに至らず、本法を確立することはできなかった。一方、これまでの成果で明らかとなった国内で最も高い頻度で認めるp.G544A変異の迅速診断のため、リアルタイムPCR装置を用いたCycleave PCR法を確立を試みた。その結果、野生型、ホモ接合型、ヘテロ接合型を良好に検出できるアッセイ系を確立することができた。