2019 Fiscal Year Research-status Report
GPER標的薬と遺伝子導入用高分子材料を用いた抗イヌ腫瘍自然免疫活性化の検討
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18K06008
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| Research Institution | Azabu University |
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Principal Investigator |
岡本 まり子 麻布大学, 獣医学部, 講師 (30415111)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | GPER / 膜型エストロゲン受容体 / 細胞死誘導 / 遺伝子導入用高分子 / イヌ肥満細胞腫 / 自然免疫活性化 / 抗腫瘍免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗腫瘍獲得免疫の効率よい誘導の規定因子はいくつか挙げられるが、腫瘍に対する自然免疫の効果も考慮すべき点である。瘍に対する自然免疫系を効率よく活性化させるために、以下の２点に着目した：① 腫瘍細胞に細胞死を誘導し抗原量が過多にならないようにする、② 死んだ腫瘍細胞や生き残った腫瘍細胞を樹状細胞内が効率よく取り込み、かつ細胞内に安定的に腫瘍由来DNAが存在しそれがセンサーとなって自然免疫の活性化が効率よく行われる。本研究ではこの2点が効率良く誘導されるかについて検討する。今年度は前年度に引き続き、標的細胞上のGPER発現検討および GPER標的薬による細胞死の誘導の検討を行った。イヌ肥満細胞腫細胞にGPERアゴニストを作用させると、細胞増殖が抑制され細胞死が増加することを前年度に見出している。この細胞死の形態について、アネキシンＶおよびPropidium Iodide染色により調べたところ、アネキシンＶ陽性細胞が増加しており、アポトーシスが誘導されていることが明らかになった。したがって、GPER標的薬によってイヌ肥満細胞腫細胞に効率良くアポトーシスを誘導できることが示唆された。一方、イヌ乳癌細胞を使って、GPER標的薬によってアポトーシスを誘導できるかどうか検討したが、GPER標的薬による大きな影響は認められなかった。GPERの発現量の差が原因であることが考えられるが詳細な検討が必要かもしれない。次に遺伝子導入用高分子材料を用いた抗原取り込みについて検討した。マウス樹状細胞株を用いて、高分子遺伝子導入材料の存在化で細胞が効率よくFITC-OVAを取り込むことを明らかにしたため、活性化マーカーやMHC分子などの細胞表面マーカーの発現変化を調べたが、予想に反して差は認められなかった。腫瘍細胞を取り込む場合と結果が異なる可能性もあるためOVAを発現する肥満細胞腫を作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成30～令和元年前半にかけて、まずGPER標的薬による細胞死の誘導の検討を計画していた。具体的には、1. イヌ腫瘍細胞上のGPER発現の確認、2. GPER標的薬によるイヌ腫瘍細胞の細胞死誘導検討、3. GPER標的薬によるイヌ腫瘍細胞上の免疫回避分子(PD-1, LAG3等)の発現影響を解析し、細胞死誘導・自然免疫活性化の手がかりを検討、であるが、１．と２．については検討済みで明らかにした。３．については、イヌ肥満細胞腫細胞上の細胞増殖に関わる受容体の発現についてはGPER標的薬は影響を与えず、GPER標的薬は細胞増殖のシグナル経路には直接関与しないことが示唆された。しかし、免疫回避分子の発現解析については今後の検討が必要であるものの、GPER標的薬作用後のイヌ肥満細胞腫細胞の細胞解析および、マウス肥満細胞腫細胞を使用したin vivo実験を行っており、ある程度これまでの結果と一致する結果を得ている。次に、高分子材料による樹状細胞内での腫瘍由来DNAの安定性促進検討を令和元年から２年度に行うことを計画していた。アルギニンを付加した高分子遺伝子導入材料がタンパク質抗原を効率よくマウス樹状細胞株に取り込ませることを明らかにしたものの、腫瘍細胞の取り込みについてはまだ取り込みの基本的条件確立ができていない。腫瘍細胞上のCD47分子からのシグナルが樹状細胞による取り込みを抑制することが知られているため、抗CD47抗体を使って抑制シグナルをブロックし、腫瘍細胞（および腫瘍細胞由来のDNA)の取り込み条件を確立していく必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30～令和元年前半を目安にGPER標的薬による細胞死の誘導の検討の遂行を当初計画していた。 すなわち、１．イヌ腫瘍細胞上のGPER発現の確認、２. GPER標的薬によるイヌ腫瘍細胞の細胞死誘導検討、３. GPER標的薬によるイヌ腫瘍細胞上の免疫回避分子 (PD-1, LAG3等)の発現影響を解析し、細胞死誘導・自然免疫活性化の手がかりを検討、を計画している。このうち３．について一部の表面分子については検討済みだが、他の分子についても検討していく。 次に、令和元～２年度に高分子材料による樹状細胞内での腫瘍由来DNAの安定性促進検討を当初計画していた。すなわち、１．DC2.4に腫瘍細胞を貪食させ、腫瘍由来のDNAを効率よく検出できる実験条件の確立、２． DC2.4のみと比べ、作用後腫瘍由来DNAの細胞内存在量が高くなる高分子材料の探索・検討、３． １． および２．で同定した高分子材料を使用した腫瘍細胞貪食後の樹状細胞活性化の検討、を計画している。これらについては、一部は検討済みであるが、条件系の確立に至っていない点があるため、さらなる検討が必要である。
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| Causes of Carryover |
購入試薬が発注した時期にメーカーがセール（キャンペーン）を行っており、当初の想定より安い価格で購入することができたため、次年度使用額が生じた。こ れについては、令和２年度に消耗品費に充てる予定である。
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