2020 Fiscal Year Research-status Report
低造腫瘍性を示すアフリカツメガエルのゲノム情報による原因遺伝子同定とヒトへの応用
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18K06013
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
田中 利明 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (40263446)
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2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Cdk阻害因子 / 造腫瘍性 / Cyclin E / アフリカツメガエル / 胞胚中期 / 尾芽胚 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
X.laevisにみられる低造腫瘍性の原因を探るために実施した遺伝子発現量のin silico比較解析により、X.laevisで特異的な発現様式を示す因子としてCyclin E1を見出した。一般的にCyclin Eは、細胞周期を直接制御し、細胞増殖の調節を行っている因子であるため、Cdk阻害因子に依存しないX.laevisの低造腫瘍性の原因遺伝子として係わる可能性が考えられた。
Cyclin Eタンパク質は、体細胞周期のG1期に発現してS期に分解することにより結合パートナーCdkの活性を制御し、G1/S期の制御を担っている。一方、CyclinE1タンパク質は、母性因子としてX.laevis 受精卵に多量に存在し、受精後12回の細胞周期の間は保持されるが、その後、胞胚中期から急激に分解する。その機能は長年に渡り不明であることから、Cyclin E1の変異体を作成し、そのタンパク質を受精卵に導入することで現れる表現型から細胞に対する機能解析を行った。まず、胞胚中期での分解をうけないCyclin E1タンパク質を作成したところ、胞胚中期を含む初期発生過程に異常は認められなかったが、体細胞分裂期である尾芽胚において統計的有為に尾部の短小化が生じた。Cyclin EはCdkとの結合を通して機能を示すため、次にCdk結合部位を欠損させたCyclin E1を作成した結果、Cyclin E1の尾芽胚における機能にCdk結合は関与しないことがわかった。
この結果を受け、本年度は Cyclin E1の新規結合因子を探った。GST-CyclinE1 およびその変異体を受精卵にマイクロインジェクションし、胞胚中期の前後において glutathione ビーズにより回収した。ここに結合した因子を質量分析により解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では、CDK阻害因子以外の低造腫瘍性原因の候補としてCyclin E1に着目し、検討を進めている。昨年度までに統計的に有為な結果として、Xenopus laevis 胞胚中期におけるCyclin E1タンパク質の分解が正常発生に必要であること、その分解は、後の尾芽胚期の尾部形成に必要であること、および、Cyclin E1の尾芽胚における働きに既知の結合パートナーであるCdkは関与しないことを明らかにした。そこで、X.laevis初期胚におけるCyclin E1の機能解明を目指し、GST-CyclinE1 およびその変異体をもちいてCyclinE1 結合因子の探索を進めた。
一方、この過程遂行中に、在籍大学が新型コロナ流行に伴う出校禁止措置となったことから、2020年4月初旬に本研究課題に使用する X.laevis の処分を余儀なくされた。
Xenopus laevis を新たに準備するためには、腹内の卵が実験に使用可能な質であるかどうかを個体毎にチェックする必要があり、個体選別に多くの時間が必要となったため、その後の2020年度計画が実施できなくなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度後半において X.laevis を新たに準備し、GST-CyclinE1 およびその変異体タンパク質のマイクロインジェクション実験の再開に至った。母性Cyclin E1タンパク質が分解する胞胚中期の前後において、再度、GST-CyclinE1 およびその変異体タンパク質をglutathione ビーズによって回収した。今後、CyclinE1およびその変異体に結合した因子を質量分析によって解析し、そこから得られる情報を基に、CyclinE1による、CDK に依存しない細胞増殖の調節機構を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
2020年度の本研究計画においては、新型コロナ流行に伴い4月初旬より在籍大学が出校禁止措置となったことから研究実施が困難となった。また、これと同時に本研究課題に使用する X. laevis の処分を余儀なくされたため、本年度は、出校可能となった夏以降の期間により、X.laevis タンパク質マイクロインジェクション実験系の再立ち上げ、および、立ち上げた新たな実験系によるデータの追試を行った。
科学研究費助成事業補助事業期間延長承認申請書により1年間の研究期間延長が認められたことから、今後、2020年度に実施予定であったCyclinE1およびその変異体に結合した因子の質量分析による同定、および、機能解析を実施するための費用として助成金を使用する。
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