2018 Fiscal Year Research-status Report
Attempts to visualize mechanisms by which psychological stress regulates the immune system
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18K06020
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| Research Institution | Nippon Veterinary and Life Science University |
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Principal Investigator |
有村 裕 日本獣医生命科学大学, 応用生命科学部, 教授 (10281677)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤井 渉 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (40708161)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ストレス / 免疫応答 / レポーターマウス / 免疫疾患 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心理的な状態と免疫系は強く結びついており、免疫応答はしばしば心理的ストレスによって修飾される。本研究では、この結びつきを抽出することを試みている。実際にストレスがどのように免疫系に影響しているか、それを調べるためにまず、ストレスの経時的な変動量、もしくは蓄積量、免疫系に生じた変化を可視化することで、そのメカニズムの詳細を明らかにするのが本研究の目的である。
今年度は、まず報告に報告されたストレスで誘導される遺伝子（以下、ストレス関連遺伝子）について自分たちの手で再現性、または我々の研究手法への適性を検討した。その結果、いくつかの遺伝子は確かに発現誘導されことから、これまで例えばヒトではストレスホルモンか唾液アミラーゼをストレス量の指標にして来たが、これらの遺伝子も十分にストレス量の指標になることを示唆している。２つ目には、 ストレス関連遺伝子のうちの２つについてプロモーター解析を試みたが、今のところストレス感受性を反映できるプラスミドの構築には至っていない。一方、ストレス関連遺伝子の１つを用いたレポーターマウスの作成を試みており、これについては作出に成功したと判断できるような結果を得た。詳細については来年度に解析する予定であるが、本研究の核となる重要な進展であり、in vivoのストレス解析、さらに組織・細胞ごとの解析を可能にするものである。３つ目には、自己免疫疾患のモデルマウスの解析方法の検討を行った。その方法としてフローサイトメーターによる解析、ならびに凍結切片を用いた免疫組織染色を自分たちの手で試み、各種抗体の有用性、標的分子の検出が可能かを確かめた。来年度以降レポーターマウスと掛け合わせ、ストレスが疾患の発症、症状の進行などにどのように関与するかを明らかにするための土台作りを進めている。今年度の３つのアプローチはどれも一定の進展が得られたと思われる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概要にも記載したように、今年度は、３つのアプローチを同時進行した。
１つ目は、ストレスでどの遺伝子が誘導されるかについての解析である。これまでにin vivoのストレス、または合成ストレスホルモン（デキサメサゾン）により発現が上昇することが報告されている遺伝子（ストレス関連遺伝子）に注目し、自分たちの手でその再現性を確かめる実験を行った。マウスに拘束ストレス、水浸ストレス、または両方のストレスを施し、ストレス関連遺伝子の変動を解析した。その結果、主としてGilz, Rtp801、Mkp-1の３つの遺伝子の発現が上昇した。
２つ目のアプローチの前半は、Gilz, Rtp801のプロモーター解析である。これを行うために、これらの遺伝子の転写開始点の上流１kb、2kbをルシフェラーゼ発現ベクターに挿入し、それらを培養細胞に導入後にデキサメサゾンで刺激し、発現の変動を解析した。しかしながら、今のところ、刺激に応じてルシフェラーゼ活性が上昇することはないため、ストレスに反応するようなプロモーター配列を適切に選択できていないと思われる。今後さらに別の配列部位をベクターに挿入する予定である。２つ目の後半としては、Rtp801のレポーターマウスの作成を試み、その作成は着実に進んだ。何匹か生まれてきたマウスについて、デキサメサゾンに対する反応性を予備実験として調べたところ、確かに反応性が認められ、目標とするマウスが出来てきていると判断された。
３つ目は、自己免疫疾患のモデルマウスの解析方法の確認である。全身性エリテマトーデスのモデルマウスであるMRL-lprマウスについて、これをフローサイトメーター解析、ならびに凍結切片を用いた免疫組織染色による解析を行うべく、自分たちの手でどの抗体であれば染色可能であるかについて検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、今年度に引き続き３つのアプローチで進める。まず１つ目は、Gilz、Rtp801のプロモーター解析を試みる。今年度に試みたGilz遺伝子の上流1kb、2kbでは不十分であると思われたので、より広範囲の配列をベクターに挿入するために、Gilzの全領域のゲノムDNAを有するBACクローンを入手し、これを鋳型に5kb以上をPCRで増幅し、ベクターに挿入する予定である。２つ目はストレスを可視化できるレポーターマウスの作出を続けていく。Rtp801のレポーターマウスについては、現在クリーニング中であり、それが終わりしだい本学に導入し、解析をスタートさせる。例えば、受けたストレス量を正確に反映するかを見るために、マウスにin vivoならびにin vitroで様々なストレスを与え、GFP発現量、さらにその持続時間を解析する。また今後、BALB/c、B6などの純系マウスに戻し交配しつつ、遺伝子背景を揃えていく。マウスは系統によって免疫応答の方向性が異なり、加えてストレス感受性も異なるため、２系統の比較は興味深い。さらにCRH-KO、GRコンジェニックと掛け合わせ、ストレス伝達分子の必要性について検討する。さらにGilzのレポーターマウスについても作成を継続する。３つ目には、ストレスがどのように免疫関連疾患に影響するかを最終的に明らかにしていくために、疾患モデルマウスを用いた解析をさらに準備していく。今年度、準備を開始したMRL-lprマウスの解析方法のうち、抗体の選定や免疫組織染色の改善を進める。またアレルギー疾患の１つであるアトピー性皮膚炎に対するストレス関与の仕組みを明らかにするために、その前段階としてマウスに皮膚炎を誘導する実験を実施する。ストレスがいかにアレルギーを増悪させるか、in vivoストレスが疾患スコアに与える影響を比較するための準備を行う。
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| Causes of Carryover |
残金は305円で、物品費を使用する際の端数に過ぎない。
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