2018 Fiscal Year Research-status Report
Evaluation of physiologocal roles of USP2 in energy metabolism by using cell-specific knockout models
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18K06035
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| Research Institution | Rakuno Gakuen University |
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Principal Investigator |
北村 浩 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (80312403)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 遺伝子改変マウス / ユビキチン / 視床下部 / 筋芽細胞 / インスリン抵抗性 / USP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．Usp2fl/flマウスと骨格筋選択的Cre発現マウスの交配により、成熟骨格筋選択的USP2ノックアウトマウスを作製し、長期で高脂肪餌を給餌したところ、摂餌量や体重に変化は見られなかった。しかしながらグルコース耐性試験で評価されるグルコース感受性やインスリン耐性試験で得られるインスリン感受性がノックアウトマウスで有意に悪化した。以上から骨格筋においてUSP2がエネルギー代謝制御を行うことが分かった。
２．USP2遺伝子の欠損筋芽細胞からミトコンドリアを分離し、各電子伝達系複合体の活性を測定したところ正常細胞と差は認められなかった。しかしミトコンドリア膜電位の低下がみられ、細胞内ATPの量の有意な低下がみられた。つまりUSP2は筋芽細胞においてもエネルギー代謝を制御することが示せた。またこのようなUSP2欠損筋芽細胞は分化能や増殖能も有意に低下した。
３．通常のin situハイブリダイゼーション法と比べ、大きく定量性が向上した1分子蛍光in situハイブリダイゼーション法で間脳視床下部でのUSP2の発現を調べたところ、弓状核のNPY産生ニューロンで低血糖時に特に発現が増加することを見出した。一方、USP2選択的阻害剤を視床下部の底部に投与したところ、明確な摂餌量の低下がみられた。つまりUSP2が新たな摂食制御分子であることを明らかにした。
４．活性化した細胞で転写が高まる遺伝子を最初期遺伝子という。タモキシフェン投与後、この最初期遺伝子であるArc, Fosを発現した細胞で赤色蛍光を発するレポーターマウスを作製した。この活性化細胞レポーターマウスを用いて低血糖や高血糖時に赤色蛍光を発する細胞をスクリーニングを開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1分子in situハイブリダイゼーションを用いてUSP2の発現が変化する脳の細胞を明らかにしたり、USP2の選択的阻害剤の視床下部内投与により食欲への効果を示す結果を得たので脳に対する評価は順当と言える。骨格筋選択的USP2ノックアウトマウスの解析も時間のかかる高脂肪餌給餌実験を実施し表現型の変化が観察されたことは充分成果を得たと考える。筋再生に関しては個体での検証がまだであるが、細胞株を用いた検証でミトコンドリア機能の変化を捉えることに成功した。最初期遺伝子の活性化が可視化できるレポーターマウスを用いた血糖感受性細胞のスクリーニングを開始する段階まで来たので概ね順調に実施できていると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.間脳視床下部のUSP2が食欲を制御する分子機構を明らかにすると共に、他のエネルギー代謝機能調節、即ち、自律神経系・内分泌系に対する役割を検証する。またUSP2の直接的・間接的な作用標的を探索する。
2.骨格筋のUSP2については、グルコースやインスリンに対する感受性の変化を個体または培養細胞で検証し、その分子メカニズムを明らかにする。また筋損傷モデルの再生の経過を野生型マウスと筋選択的USP2ノックアウトマウスで比較する。
3.筋芽細胞のミトコンドリア機能不全の分子メカニズムを検証する。
4.最初期遺伝子レポーターマウスを用いて高血糖や低血糖時に活性化する細胞をモニタリングする。
5.最初期遺伝子CreマウスとUsp2fl/flマウスの交配で得られる活性化細胞依存的Usp2ノックアウトマウスを作製し、高血糖や低血糖時に活性化する細胞におけるUSP2の役割を調べる。
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| Causes of Carryover |
レポーターマウスの繁殖と実験に使用する個体数の確保が予想以上に時間がかかり、繰り越しの必要が生じた。
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[Journal Article] Macrophages Switch Their Phenotype by Regulating Maf Expression during Different Phases of Inflammation2018
Author(s)
Kenta Kikuchi, Mayumi Iida, Naoki Ikeda, Shigetaka Moriyama, Michito Hamada, Satoru Takahashi, Hiroshi Kitamura, Takashi Watanabe, Yoshinori Hasegawa, Koji Hase, Takeshi Fukuhara, Hideyo Sato, Eri H. Kobayashi, Takafumi Suzuki, Masayuki Yamamoto, Masato Tanaka, Kenichi Asano
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Journal Title
Journal of Immunology
Volume: 201
Pages: 635-651
DOI
Peer Reviewed
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