2018 Fiscal Year Research-status Report
Identification of novel and powerful constitutive promoter than CAG
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18K06039
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
中武 悠樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (20415251)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 恒常的プロモーター / CAGプロモーター / 遺伝子発現 / 発現ベクター / 合成生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、既存のCAGプロモータを超える、汎用性の高いプロモータを同定することを目的としている。下流遺伝子の恒常的発現を誘導するプロモータを新規に同定し、発現ベクターとして利用し、その有用性を評価する。申請書に記載されている手順に従い、In-Silicoにて、ヒト培養細胞等で高発現する遺伝子を網羅的に同定し、そのうちEEF2、TPT1、RPL27、RPL11、OAZ1、TUBA1BおよびHSPA8について、転写開始点上流から2ｋｂを取得した。これらのレポーター遺伝子コンストラクトを構築し、マウスおよびヒトES細胞に導入したところ、未分化な細胞状態では、CAGプロモーターと同等かやや劣る程度の転写活性を有していた。また、これらレポーターを成熟した筋細胞系に分化誘導できるMYYOD1誘導株に導入し、同様に転写活性を比較した。未分化状態と同様、これらの新規同定したプロモーターは転写活性を有していたが、比較対照となるCAGプロモーターより高い活性は得られなかった。一方、新規同定したプロモーターのうち、TPT1およびHSPA8に関しては、CAGプロモーターよりも活性の変動が少なく、既存の分子生物学的ツールとして使用されているPGKプロモーターと比べると、活性が高いことがあきらかとなった。
以上から、本研究により同定された新規恒常的プロモーターは、CAGよりは活性強度に劣るものの、十分な転写活性を有し、分化状態に左右されない安定的な分子生物学的ツールとなりえると考えられた。これらは、第41回分子生物学会年会に発表され、さらなる研究を進めていきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、既存の高発現プロモーターであるCAGプロモーターより優れた新規プロモーターを同定することである。より高発現で、より安定的な恒常的プロモーターの同定を目的とし、研究を進めてきた。
研究計画通り、新規の恒常的な発現をする遺伝子を網羅的に同定でき、その遺伝子群のプロモータを新規に単離・解析し、複数の動物種および細胞系譜において転写活性を評価できている。新規に同定したプロモーターは、既存の高発現プロモーターとして知られるCAGプロモーターと比較できるほどの転写活性を有しており、申請書の計画通りマウスおよびヒトES細胞にて、活性を測定している。申請した研究計画では、高い活性を有するCAGプロモータと同等かそれ以上の転写活性を有するプロモーターを同定する予定であったが、実際に同定されたプロモーター群は、CAGより顕著に高い活性を持っていなかった。
安定的な発現レベルという観点では、同定している新規プロモーターは、CAGより優れており、かつ、分子生物学的ツールとして汎用されているPGKプロモーターより活性強度も優れていた。このため、目的の半分は到達できていると考えられ、総じて順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画では、本年度中にCAGプロモーターよりも高レベルな発現強度を有するプロモーターを同定できると予想していたが、実際に検討した結果、安定的なプロモーターを取得することしかできていないため、いくつかの研究計画を変更する必要が生じている。
そこで、研究計画の一部を変更し、継続的に強力なプロモーターを同定する研究過程と、同定された新規プロモーターの詳細な解析をおこなう研究を並行する。つまり、後者の解析を申請書に記載されている研究計画にもとづいて進め、前者の強力なプロモーターの探索に対して、新たに研究計画を立案する。具体的には、同定された配列の活性を、Sirial delitionを施したレポーターアッセイをおこなうことで、転写活性を有する領域を500bp程度位まで絞り込めるか検討する。サイズダウンが成功すれば、3～6つの同配列をタンデム化することで、転写活性の強化が見込まれる。また、CAGプロモーターはイントロン構造を有しているため、イントロンを共通にしたレポーターを新たに作成し、厳密な比較をおこなう。
以上のように計画を若干変更することで、当初の研究目的は達成できると考えているが、さらに改変の必要が生じた場合は、適宜修正をおこなう予定である。
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| Causes of Carryover |
当初計画していた研究プランより、基礎的な解析を重点的に進める必要が生じたため、結果として安価な解析で進めることができた。本年度は、より応用的な解析を重点的に進めるため、去年度より研究費を多く充てる予定である。
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Research Products
(1 results)
