2018 Fiscal Year Research-status Report

Production of humanized mouse models for chronic recurrent multifocal osteomyelitis and antiinflammatory drug development

Research Project

Project/Area Number	18K06041
Research Institution	Tokai University
Principal Investigator	阿部幸一郎東海大学, 医学部, 准教授 (90294123)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	荒木喜美熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (90211705)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	自己炎症性症候群 / 自己炎症性骨疾患 / 疾患モデル / 変異マウス / チロシンキナーゼ / Srcファミリー / 指定難病
Outline of Annual Research Achievements	慢性再発性多発性骨髄炎（CRMO)は、複数部位の骨に炎症による骨破壊、骨痛、発熱を呈し、再発と寛解を繰り返す希な疾患である。この疾患は感染症や腫瘍などの特定の原因によらない慢性非細菌性骨髄炎（CNO)に含まれる。また、自己抗体や自己反応性T細胞の関与が特定されないことから自己免疫疾患とは区別され、自然免疫系が原因となる自己炎症によると考えられている。このため自己炎症性骨疾患とも呼ばれる。指定難病であり、原因は不明であり治療法は限られている。我々は、自己炎症性症候群のモデルとなる変異マウスの解析を行って、その結果明らかとなった原因遺伝子のSrcファミリーチロシンキナーゼ（SFK)を対象に研究を行っている。米国との共同研究によりCRMO患者のエキソーム解析で、同遺伝子の変異が複数検出された。しかし、これらの変異は、マウスで見つかった変異とは異なる部位のアミノ酸置換を伴う変異であるため、同じメカニズムで発症するかどうかについては不明である。そこで本研究では、これらのCRMO患者で見つかった変異をマウス個体へと導入して、その表現型を詳細に解析することによって新たな疾患モデルを作製することを主な目的としている。さらにこの系統を用いて、新たな分子標的薬のスクリーニング系を確立することを目指している。今年度は変異型のヒト型遺伝子を導入することを目標として、その前段階として目的遺伝子にレポーター遺伝子であるb-geoをノックインしたマウスを作製し解析を行った。原因遺伝子座に導入したレポーター遺伝子の発現を見るために、発現が予想される組織を用いてX-gaを基質にした組織染色を行った。しかし、現在までのところ組織レベルでの発現は認められておらず、発現レベルが低いか発現する細胞の数が少ないことが予想された。今後、感度の高い基質を用いるか、レポーター遺伝子をCreなどに置換することが考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 目的遺伝子座にレポーター遺伝子をノックインした系統において、予想通りのパターンでレポーター発現が認められなかったことから、ヒト型遺伝子導入マウスの作製が遅れている。その理由は、レポーター遺伝子付近に同時に変異型lox配列を挿入しており、この配列を利用してヒト型遺伝子を導入することを計画している。よって、レポーター発現が確認されない理由として、挿入部位付近のゲノム配列の再構成などが起こっている可能性も考えられた。そこで、レポーター発現をRT-PCRや組織・細胞染色において蛍光基質を用いるなどして感度を上げることを検討している。もう既にヒト型遺伝子への変異導入などのコンストラクションは終わっており、レポーター発現が確認され次第、ヒト型遺伝子変異導入マウス系統を作製したいと考えている。
Strategy for Future Research Activity	ヒト型遺伝子導入マウスについては、レポーター遺伝子導入系統との関連があるためにレポーター発現を調べることが先決である。しかし、マウスの内在性の原因遺伝子座にヒト型の遺伝子変異を導入することについては問題がないので、研究計画を進めている。既にゲノム編集に用いるpX330のコンストラクションは終了しており、変異導入に用いる合成オリゴDNAについても準備が整っている。よって、これらを通常のマイクロインジェクションによって受精卵に導入することによって、マウス遺伝子にヒト型変異を導入した系統が得られると考えられる。よってこの系統の作製と解析を同時に進めながら、ヒト型遺伝子導入マウスの作製も進めて行きたい。
Causes of Carryover	計画したレポーターマウス系統の作製は順調に進んでおり、また、ヒト型遺伝子導入マウス系統作製のコンストラクトの作製も完了している。しかし、レポーター発現が確認できなかったために、計画には記載していなかった解析を新たに行っている。このため、計画がやや遅れたことにより当該助成金が生じたが、何らかの発現の確認ができれば、計画通りにマウス系統の作製が行うことができる状況にある。