2018 Fiscal Year Research-status Report
希少な異種マウスのES細胞樹立と４倍体胚盤胞補完法による系統保存と個体復元
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18K06045
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
持田 慶司 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 専任技師 (60312287)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 野生由来異種マウス / 個体復元 / ES細胞樹立 / 4倍体胚盤胞補完法 / 凍結保存 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウスは最も多用されている実験動物であり、近年では世界各地で捕獲され遺伝的隔たりの大きい野生由来の異種マウスとの遺伝子機能の比較研究が発癌や老化など様々な分野で進行している。我々は今までに数千系統の実験用マウスと亜種関係にあたる野生由来のマウス40系統の受精卵凍結保存および産子への復元に成功し報告してきた。しかしMus musculus以外の異種マウス系統の配偶子や受精卵による凍結保存は成功例の報告がなく、常に絶滅の危機に直面している。本研究で我々は異種マウスから高品質の受精卵を採取し、体外増殖および半永久的に保存の可能な多能性幹細胞であるES細胞の樹立および凍結保存を試み、ES細胞を用いる新しい系統保存法の確立を開始した。
まず亜種マウスの中でも過剰排卵・体外受精・胚移植などの生殖工学技術の適応が困難なMus mus. castaneusのCASP系統を用いたところ、雌雄同居により低率ながら交配の確認できた2匹の雌から13個の形態的に良好な胚盤胞を獲得でき、最終的に3ラインのES細胞株の樹立に成功した。更に異種であるM. spicilegusのZBNおよびSPIの2系統は体外胚培養が困難なことから、体外受精直後の前核期胚を偽妊娠マウスの卵管内へ移植し、その3日後に子宮を灌流することで体内で発育した20個および5個の胚盤胞を獲得でき、それぞれ6ラインおよび4ラインのES細胞株を樹立し凍結保存できた。異種マウスのES細胞を樹立したという論文は報告されておらず、ES細胞を介した系統保存としては初めての例となる。
今後は胎盤にしか寄与できない4倍体胚へのES細胞の注入を行い、ES細胞から初めての異種産子作出を試みる。産子作出が可能になれば、更にES細胞に遺伝子変異の導入も可能と考えられ、また母体と異種産子との胎盤や体細胞における相互作用など様々な解析への利用が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の研究により、予定していた異種マウスであるMus spicilegus に属する2系統、Mus spretus に属する2系統、Mus caroli に属する1系統のうち、Mus spicilegus に属するZBNとSPIの2系統および亜種マウスであるM. m. castaneusのCASP系統の合計3系統でES細胞株の樹立に成功した。いずれも受精卵および発生の進行した高品質の胚盤胞の獲得や受精卵を用いた系統保存が困難な系統であったが、できる限りin vivoでの環境を利用するために体外受精直後の前核期で胚移植を行った偽妊娠雌や自然交配後の雌の子宮から発生の進んだ桑実期胚～胚盤胞を回収できたことが成功に繋がったと考えられる。
加えて、これらES細胞を注入するホスト胚の作出を進めた。ホスト胚は体外受精によって作出した2細胞期胚を電気融合法により1細胞（4倍体）とし、これが2細胞となった時点で凍結保存を行った。初年度のうちに、クローズドコロニーであるICR系統とGFPを導入したC57BL/6系統の保存を進め、かつ一部の胚を培養して形態的に良好な胚盤胞へ発生するまでの時間の計測を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
まだ作出できていないES細胞の樹立を、Mus spretus およびMus caroli に属する系統について進める。これらの系統は計画的な交配・過剰排卵・排卵卵子の採取・体外受精・体外胚培養と様々な生殖工学的作業が困難なことから、数多くの高品質な胚盤胞を獲得するのは難しいと予想される。一方で異種マウス系統においても、品質が良好であれば胚盤胞からＥＳ細胞の樹立が行えた初年度の実績から、少なくとも幾つかの発生能の高い胚を獲得できれば、ＥＳ細胞の樹立が期待できる。
一方で初年度に樹立したES細胞株の評価を行う予定である。すなわち、未分化状態の確認（アルカリフォスファターゼ活性）および簡易核型解析と雌雄解析を行うことで、産子作出に用いるべきES細胞株を各系統あたり複数ライン選定する。
次に選定されたES細胞を用いて、ES細胞由来の産子作出を進める。具体的には、昨年秋以降に発表されたNakauchiおよびOkumuraらの論文で報告されているように、ホスト胚の系統や発育段階と導入方法、更に用いるES細胞数等によってキメラの効率や寄与率が異なることから、ホスト4倍体胚の系統（3種類準備済み）、発育段階（8細胞期胚もしくは胚盤胞）、およびES細胞の導入方法（注入法もしくは凝集法）を検討し、ES細胞からの産子作出を進める予定である。
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